《The Journal of Physiology》：Novel volume-electron microscopic ultrastructural analysis of gastrointestinal excitability associated with calcium–activated chloride channels
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这篇综述聚焦胃肠道起搏细胞（ICC）的兴奋性机制，特别是钙激活氯通道（CaCC）的功能。文章系统回顾了传统技术（如免疫组化和透射电镜）在识别ICC亚型及其功能中的应用，并重点介绍了新型体积电子显微镜（vEM，如FIB/SEM）的三维几何分析能力。该技术可精确定量分析ICC微域内内质网（ER）、质膜（PM）和线粒体之间的空间构象，为理解Ca2+依赖的起搏活动机制提供了前所未有的超微结构见解，有望推动相关胃肠道动力疾病的研究。
引言
胃肠道平滑肌细胞的兴奋性受到一个功能性合胞体（SIP-syncytium）的精密调控，这个合胞体由平滑肌细胞（SMCs）、Cajal间质细胞（ICCs）和血小板衍生生长因子受体α阳性细胞（PDGFRα+ cells）共同组成。其中，ICCs是关键的起搏细胞，能够产生自发的起搏电位。这一过程的核心是钙激活氯通道（Ca2+-activated Cl?channel, CaCC，如Ano1/TMEM16A）的表达与功能。CaCC的激活高度依赖于细胞内局部Ca2+浓度的瞬时升高，而Ca2+的主要来源是内质网（ER）。因此，一个由质膜（PM）、内质网和线粒体共同构成的“微域”（microdomain）或“起搏单元”（pacemaker unit）的概念被提出，被认为是协调Ca2+释放、信号传递与缓冲的几何与功能单元。然而，理解其完整结构和功能需要详细的三维信息。传统的透射电子显微镜（TEM）尽管提供了关键的二维超微结构信息，但在揭示这些细胞器复杂的三维空间关系方面存在局限。本篇综述旨在介绍一种新兴的体积电子显微镜（volume-electron microscopy, vEM）技术，特别是聚焦离子束/扫描电子显微镜（Focused Ion Beam/Scanning Electron Microscopy, FIB/SEM），如何推动我们对ICC中CaCC功能及相关兴奋性机制的解剖学理解。
胃肠道兴奋性相关细胞的鉴定
通过免疫组化获得的蛋白质与通道信息
长期以来，c-Kit是鉴定ICCs的主要标志物。然而，c-Kit免疫组化存在一定局限性，例如在c-kit突变小鼠中某些ICC亚型仍然存在但难以检测。近年来，编码CaCC的蛋白Ano1（TMEM16a）成为另一个可靠的ICC标志物。在胃肠道中，Ano1特异性地在ICCs中表达。研究表明，所有c-Kit阳性的ICCs也同时表达Ano1。Ano1对于ICC产生自发性膜电位（称为“慢波”）和维持数秒的平台期去极化至关重要，这两者是ICC起搏活动的关键组成部分。尽管Ano1在ICC中普遍表达，但不同研究报道了其对拮抗剂的药理学反应存在差异，这可能与Ano1剪接变体、细胞内Ca2+水平或通道的微观几何环境有关，而电子显微镜，特别是新的三维几何分析，可能是解释这种变异的有力工具。
通过电子显微镜获得的超微结构信息
除了蛋白标志物，透射电镜（TEM）的超微结构分析是鉴定SIP合胞体中细胞的可靠方法。ICCs和PDGFRα+细胞在光镜下分布邻近、形态相似，但在电镜下很容易区分。PDGFRα+细胞富含粗面内质网，偶尔有小缝隙连接；而ICCs则主要富含线粒体、小窝（caveolae）以及与彼此或平滑肌细胞之间的大缝隙连接。基于这些典型的超微结构特征，结合免疫组化和TEM分析，研究者们发现并描述了一些新的ICC亚型，并推测了其新功能。例如，分布在结肠近端浆膜下层的ICC-SS，其特征性多极形态形成单层网络，且该区域神经支配稀疏，TEM显示其与纵肌层细胞之间缺乏缝隙连接，而是存在桩-窝膜连接（peg-and-socket junctions），这提示它们可能作为机械传感器发挥作用。而分布在黏膜下层的ICC-SP则被观察到拥有异常多的缝隙连接，形成了类似电缆的强电耦合结构，可能与黏膜分泌和吸收的调节有关。这些来自二维超微结构的信息为推测生理功能提供了新假说，特别擅长探索膜水平的细胞相互作用细节，但对于理解Ca2+兴奋机制和ER的复杂分布仍有局限。
新型vEM技术对内质网及内质网-质膜接触的分析
新型体积电子显微镜（vEM）技术，如FIB/SEM，能够在超微结构水平产生三维图像。与光镜下无法分辨单个细胞器、传统TEM难以呈现整体形状和密度不同，FIB/SEM可以对目标体积内的细胞器进行三维重建和定量分析。例如，在线粒体的分析中，FIB/SEM图像清晰地展示了它们多样化的形状，包括圆形、长形和分支形，这是传统TEM图像难以构建的。
FIB/SEM尤其适用于分析膜接触或囊泡等结构，因为它能提供最小的Z轴分辨率（层间间隔）。这对于判断两个结构是否紧密接触或连续至关重要。内质网在细胞质中具有复杂的网状分布，其真实结构直到vEM分析出现后才变得清晰。对运动神经元的研究发现，其内质网的分布并不均匀，呈现核周（片层状丰富）和外周（相对稀疏）的差异，且这种分布在细胞损伤后发生显著改变，变得更为均匀。更重要的是，FIB/SEM能够以片层结构清晰展示内质网与质膜之间的膜接触，并定量计算出接触面积。研究发现，运动神经元损伤后，内质网-质膜接触的面积显著增加，这为神经再生机制提供了新的见解。同样，利用FIB/SEM进行内质网分析，也是理解CaCC功能的有力工具，因为内质网的排列及其与质膜的几何相互作用是维持其生理功能的关键因素。
聚焦于CaCC的内质网形态与微域几何分析
本文将讨论与Ca2+相关细胞兴奋性，特别是ICCs中CaCC相关的细胞器结构。除了CaCC，库操纵性钙内流（SOCE）、钠钙交换体（NCX）和钠钾氯协同转运体（NKCC1）等机制对于启动和维持ICC起搏活动也至关重要。这些成分与质膜、内质网和线粒体之间几何上紧密的相互作用，是离子稳态和CaCC激活所必需的。理解这些调节成分与PM、ER、线粒体的结构组织——“微域”，对于解释其生理功能至关重要。
当通过FIB/SEM检查SIP合胞体中内质网的轮廓时，发现不同细胞类型的内质网形态完全不同。在平滑肌细胞中，肌浆网（SR）明显分为核周和外周两类，且互不连接。而在ICCs和PDGFRα+细胞中，内质网的分布相对均匀，遍布整个细胞质，但细节特征不同：ICCs具有网状内质网，而PDGFRα+细胞具有片层状内质网。这暗示它们的功能机制可能不尽相同。
为了分析ICCs中的CaCC，研究以小窝（caveolae）为中心设定了几何单元（微域），并假设其为Ca2+热点中心。基于平滑肌细胞研究中局部Ca2+流的空间范围，将有效作用区域的球体半径设定为400 nm。聚焦于小窝周围的三维内质网结构，在起搏型ICCs中发现了面向质膜的片层状内质网结构。通过测量重建的质膜多边形网格每个点到内质网最近点的距离，发现内质网膜与质膜之间的平均距离约为100 nm。
为了维持ICCs起搏活动中的Ca2+稳态，调节SOCE的机制依赖于基质相互作用分子（STIM）/Orai蛋白的相互作用，这是讨论内质网-质膜接触的代表性机制。然而，在ICCs中很少检测到传统电镜在培养细胞中报道的与质膜紧密相对的“大片内质网膜”。STIM/Orai机制的存在与三维电镜揭示的内质网-质膜几何信息之间的差异，可能对ICC起搏器的Ca2+振荡机制提出了新的问题和视角。典型的STIM/Orai系统中的内质网-质膜接触通常小于30 nm。目前观察到的平均100 nm的距离，可能反映了ICCs在稳态下为形成20-30 nm紧密接触所做的“准备”程度，这个数字或许与ICCs的起搏活动水平相关。
线粒体的空间排布也因其在调节胞质Ca2+浓度中的作用而被研究。在平滑肌细胞的微域中，小窝周围很少有大量线粒体。而在起搏型ICCs中，则发现了质膜、内质网和线粒体之间的紧密相互作用。此外，在线粒体Ca2+单向转运蛋白所需的结构——线粒体相关膜（mitochondria-associated membrane, MAM）也在ICCs的小窝附近被发现。
迄今为止，在构建ICC起搏活动的计算模型时，包含线粒体在内的成分空间排布已被报道。在这些模型中，线粒体的体积、密度、与其他元素（如质膜和内质网）的距离等几何数据可能是主要参数之一。传统的模型主要基于二维信息，可能无法真实反映Ca2+的行为。通过FIB/SEM获得的三维几何信息，将成为探索新计算模型、进行精确功能模拟的强大资源。
基于球形几何分析的未来展望
利用三维几何分析表明，微域的细胞区域特异性在不同细胞中可能表现出不同的多样性。如果能在不同的ICC亚型、器官区域、年龄、发育阶段和细胞区域系统地分析vEM微域几何结构，可能会更好地理解它们的生理功能。即使在基因表达水平或蛋白表达位点水平未检测到显著差异，超微结构水平的解剖学相互作用也可能对其实际功能至关重要。例如，除了之前提到的Ano1药理学行为差异，对STIM/Orai阻断剂GSK-7975A的反应也存在差异。这些反应可能依赖于稳态下内质网与质膜物理相互作用的模式或程度，这可能调节SOCE动力学。在考虑起搏活动恢复期的动力学时，目前尚不清楚这些区域如何持续维持其物理相互作用。几何数据可以为内质网和质膜相互作用的丰度和组成提供精确信息，有助于更好地理解ICC的调控系统。
未来基于不同胃肠道病理状态下vEM微域几何结构的比较研究，也可能为其机制提供更好的理解。一些胃肠道疾病涉及ICCs的功能丧失。虽然目前尚无直接报告显示病理条件下ICCs中内质网与质膜的分离，但有报道指出Ano1缺陷或超微结构改变。然而，内质网与质膜之间的大距离可能影响细胞活动中Ca2+浓度的调节，导致功能缺陷。例如，在平滑肌细胞中，质膜与肌浆网分离的突变小鼠表现出Ca2+火花的变化。在神经科学中，大量报告表明正常的内质网-质膜相互作用崩溃会导致功能异常。
迄今为止，尚无明确证据证实Ano1的分布等同于ICCs中小窝的分布。但在我们的几何分析中，暂时将小窝假定为ICCs中CaCC相关Ca2+热点活动的代表性位点。小窝蛋白不仅在平滑肌细胞表面广泛分布，也在ICCs表面分布。虽然免疫组化分析由于这些分子的广泛密集分布而存在一些不足，但有报道称小窝蛋白-1（Cav-1）与一些Ca2+调节成分在ICCs中共定位。此外，一项关于Cav-/-小鼠回肠中ICCs缺乏Ano1的研究表明，Ano1的表达与小窝几乎等同。
目前仍有一些技术问题有待解决，例如足够的样本数量以进行统计分析，以及固定方法的人工影响。尽管高压冷冻固定（无化学固定剂）可能解决这些问题，但将该固定技术应用于胃肠道组织较为困难。即便如此，目前还没有其他工具能像FIB/SEM一样获取此类几何信息。迄今为止，一些使用常规甲醛化学固定的可靠报告也讨论了内质网-质膜相互作用，包括STIM1相关的内质网-质膜接触。假设在这些研究中结构未受到固定剂的过度影响，那么如果在相同固定条件下进行比较分析，问题会更少。
结论
目前，即使在实验室动物模型中，胃肠道的调节机制仍有许多方面尚不清楚。通过结合相关细胞的三维几何特征，可以进行更精确的分析和讨论。特别是在考虑包括CaCC在内的Ca2+激活机制时，内质网及其周围的相互作用极其重要。在生理环境下进行组织水平的分析同样重要，因为它涉及平滑肌细胞活动的调节以及包括ICCs在内的整个胃肠道，与不同组织区域细胞的相互作用对于理解其生理功能也至关重要。从这些方面来看，新的三维vEM技术使得同时进行细胞和亚细胞分析成为可能。这一优势可以加速我们对胃肠道中ICCs与平滑肌细胞兴奋机制的理解。
