首次在几内亚的城市废水中检测到Rocahepevirus病毒：一项“同一健康”警报 Bakary Doukouré, Yann Le Pennec, Cissé Fatoumata, Ramatoulaye Diallo, Issiaga Touré, No?l Tordo, Pierre Roques

《Pathogens》：First Detection of Rocahepevirus in Urban Wastewater from Guinea: A One Health Alert Bakary Doukouré, Yann Le Pennec, Cissé Fatoumata, Ramatoulaye Diallo, Issiaga Touré, No?l Tordo and Pierre Roques

本研究首次在几内亚康akry城市污水中发现Rocahepevirus ratti（RHEV），通过RT-PCR和测序确认35/180份样本携带RHEV-C1亚型，与非洲鼠类相关，提示人畜共患病风险及环境监测必要性。

　　

摘要

戊型肝炎病毒（HEV）是全球急性病毒性肝炎的主要原因之一，其动物源性基因型在人类和动物中均有发现。在非洲，关于环境中的HEV传播的数据非常有限。本文首次报告在几内亚科纳克里市的城市废水中检测到Rocahepevirus ratti（RHEV）。2024年12月至2025年4月期间，在科纳克里180个未经处理的城市废水样本中，有35个样本检测出Rocahepevirus ratti（RHEV）。通过对部分HEV ORF1基因组片段的系统发育分析，发现该病毒与非洲啮齿类动物中的RHEV菌株存在关联，这表明环境受到了污染，并对周边的人类群体构成了潜在的动物源性传播风险。这一发现强调了在西非（尤其是几内亚）实施综合“同一健康”监测的必要性，以监控HEV在人类-动物-环境之间的传播。

1. 引言

戊型肝炎病毒（HEV），也称为Paslahepevirus balayani，是全球急性病毒性肝炎的主要原因，主要通过粪-口途径传播。虽然存在特定的人类基因型，但动物源性基因型也从动物宿主体内出现，对人类健康构成潜在威胁。主要由猪传播的动物源性HEV 3型基因型已在非洲引发人类疫情。通过血清流行病学研究和从猪圈废水（PX441305）中分离出的HEV 3c（OR283252.1）的分子特征分析，证实了HEV-3在几内亚猪群中的存在。除了Paslahepevirus balayani外，其他属于不同分类群的戊型肝炎病毒也在动物群体中传播。尽管关于非洲环境中戊型肝炎病毒传播的数据仍然有限，但最近发现了主要在啮齿类动物中传播的Rocahepevirus ratti（RHEV）。该病毒偶尔也会导致人类感染。目前，科纳克里市没有集中的污水处理设施或系统的污水管理系统，而且该地区存在大量老鼠以及猪在开放环境中的自由活动。因此，本研究旨在通过“同一健康”监测项目，调查HEV在科纳克里城市废水中的存在情况，该项目由几内亚巴斯德研究所为几内亚国家卫生安全局（ANSS）开展。

2. 材料与方法

2024年12月至2025年4月期间，研究人员每周使用无菌聚丙烯瓶从科纳里市的10个区域手动采集200毫升的原始废水样本（RWWSs）。采集后立即将样本置于4°C条件下运输至实验室以保持其完整性。样本处理需在采集后三天内完成。无法通过RT-PCR或RT-qPCR检测的RNA样本会被储存在-80°C环境中，以保护其完整性。为减少对RNA检测的影响，尽量减少了冷冻-解冻的次数。

为了检测病毒，首先通过离心（3000 rpm/30分钟）澄清废水样本，然后使用聚乙二醇（PEG 8000）进行沉淀浓缩。具体操作为：向40毫升澄清后的废水中加入4克PEG 8000（10%）和0.9克NaCl（0.4 M），搅拌至完全溶解后于4°C下孵育过夜。孵育后，将样本以12,000×g的离心力离心2小时；弃去上清液，将沉淀物重新悬浮在500微升PBS中。得到的浓缩液分装后储存在-80°C环境中，直至进行RNA提取。使用Qiagen公司（德国希尔登）的QIAamp Viral RNA Mini Kit按照说明书从140微升浓缩废水中提取RNA。为考虑环境中可能存在不同基因型的戊型肝炎病毒共存的情况，所有RNA样本均使用两种特异性分子检测方法进行筛查。

首先，使用针对ORF2/3的RT-qPCR方法检测戊型肝炎病毒RNA（6），阳性样本通过针对ORF1和ORF2的嵌套RT-PCR方法进一步确认（7）。随后，使用针对ORF1的Rocahepevirus特异性嵌套RT-PCR方法进行检测（8）。RT-qPCR和嵌套RT-PCR所用引物详见补充表S1，其中包含序列和目标基因组区域信息。为明确病毒种类并排除交叉反应，阳性样本的ORF1扩增子通过针对Rocahepevirus或Paslahepevirus的特异性引物进行测序。PCR产物使用Thermo Fisher Scientific公司的Qubit系统进行纯化和定量。根据制造商说明，将DNA文库加载到Oxford Nanopore Technologies MinION平台上进行测序。原始信号数据通过条形码分配进行解复用，并进行碱基调用处理。使用ARTIC nCoV生物信息学工具链生成FASTA格式的序列，然后通过调整后的工作流程生成共识序列。这些共识序列被存入GenBank，编号为PX408741-PX408746。

最后，使用Hepatitis E病毒基因分型工具（软件版本2.22.2，工具版本1.16）鉴定突变并将每个序列分配到相应的HEV变体。

3. 结果

在180个水样中，有135个（75%）通过ORF3 Paslahepevirus特异性RT-qPCR检测呈阳性。在整个研究期间，所有10个采样点均检测到阳性RT-qPCR信号。不同采样点的Ct值存在差异，某些地点的Ct值较低（Ct >32），而其他地点的Ct值较高（Ct < 32）。图1展示了这些采样点的空间分布及18周监测期间HEV的检测频率。

图1. 科纳克里市废水中HEV检测点的空间分布。图中显示了在18周监测期间检测到HEV RNA的周数（共18周）。颜色编码表示：高病毒载量频繁检测到的地点用红色表示（约11周），中等病毒载量用黄色表示（1–4周），低病毒载量用绿色表示。蓝色圆圈表示样本的来源。基础地图 ? 2024 Google Earth。

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在135个阳性样本中，有35个通过ORF1嵌套RT-PCR得到确认（7），而没有样本通过ORF2嵌套RT-PCR得到确认。这35个样本也通过针对Rocahepevirus ratti的ORF1嵌套RT-PCR得到确认（8）。

经过ORF1嵌套RT-PCR扩增后，对12个阳性样本进行了测序。在测序过程中，分别使用HEV-3h菌株或RHEV菌株V-105的基因组作为参考（参考序列分别为JQ013794.1和JX120573）。从这些测序结果中，我们保留了12个样本中来自不同区域的6个具有代表性的样本，时间跨度为2024年12月至2025年4月。

所有与HEV参考序列JX120573对齐的样本的测序结果详见表1，其中包含了读取次数、覆盖度以及平均碱基质量和映射质量等信息。

表1. 与HEV参考序列JX120573对齐的6个样本的测序覆盖度和质量指标。

参考序列：HEV，GenBank登录号JX120573.1。读取次数：与该区域对齐的测序读取次数。覆盖碱基：至少被一个读取覆盖的碱基数量。覆盖度：每个碱基的平均读取次数（或覆盖碱基的比例）。平均深度：该区域的平均测序深度。平均碱基质量得分（Phred等级），表示碱基判定的准确性。平均映射质量得分：表示读取与参考序列对齐的准确性。

基于这900个ORF1区域核苷酸片段的系统发育分析显示，科纳里市的废水样本属于Rocahepevirus ratti的RHEV-C1亚型（图2）。科纳里市的序列（登录号：PX408741-PX408746）与喀麦隆的啮齿类动物中的HEV序列（GenBank PP764563.1-PP764564.1）具有高一致性（bootstrap值：98%）。

图2. 基于ORF1基因的900个核苷酸构建的Hepeviridae家族系统发育树，使用MEGA版本12的Neighbor-Joining方法进行构建（https://www.megasoftware.net，访问日期为2025年6月27日）。图中红色标记了来自几内亚废水的6个HEV序列和在科纳里市猪体内发现的HEV序列。数字表示支持每个节点的bootstrap百分比。

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4. 讨论/结论

这是首次报告在科纳里市废水中检测到Rocahepevirus ratti RNA（RHEV-C1）的传播。由于2023年在科纳里市的猪粪便和多个废水流中检测到基因型为3c（OR283252.1）的Paslahepevirus（PX441305），我们首先使用针对Paslahepevirus的RT-PCR方法检测废水样本，并在整个研究期间（4个月）确认了75%（135/180）的样本呈阳性。然而，我们未发现任何HEV-3 Paslahepevirus阳性样本。有趣的是，有35个样本同时对Rocahepevirus的RT-PCR检测呈阳性，并通过NGS技术进一步鉴定为RHEV-C1菌株。这些结果表明，在我们为期4个月的监测期间，Rocahepevirus ratti以广泛且持续的方式在环境中传播，某些地区的感染率较高，这可能与该地区老鼠种群密度较高有关；需要进一步开展长期和定量的研究来了解其传播动态。

选择部分ORF1序列进行测序是因为这一基因组区域常用于环境监测中的HEV分类和系统发育分析。类似的方法也应用于非洲最近的基于废水的HEV监测研究中。几内亚序列与喀麦隆啮齿类动物中的RHEV菌株的聚类结果支持了这种病毒在非洲的传播。

通过针对Rocahepevirus ratti特异性RT-PCR检测呈阳性的废水样本的序列被纳入系统发育分析，同时还包括了Hepeviridae家族的参考序列。为了说明检测到的菌株与先前描述的戊型肝炎病毒之间的关系，特意纳入了来自Rocahepevirus和Paslahepevirus谱系的代表性序列。正如预期的那样，来自几内亚猪的Paslahepevirus序列并未与Rocahepevirus ratti属于同一分支（图2）。

在科纳里市废水中检测到Rocahepevirus ratti反映了该病毒的空间分布不均现象。病毒检测频率较高的区域通常卫生条件较差，这可能促进了啮齿类动物的栖息，而它们是Rocahepevirus的宿主。这些啮齿动物常出没在人类居住区附近，增加了人类、动物和环境之间的接触频率。这一现象体现了“同一健康”概念，强调了人类、动物和环境健康之间的相互关联性。这种环境污染带来了跨物种传播给人类和/或猪的潜在风险。尽管现有数据有限，但必须在非洲（如同亚洲和欧洲）评估这一风险。在西非（特别是几内亚），建立综合监测系统显得尤为重要，该系统应定期收集有关啮齿动物和猪宿主的信息以及相关的人类暴露情况。

需要注意的是，虽然数据提供了关于科纳里市废水中Rocahepevirus ratti空间分布的见解，但任何关于其持续传播或传播的结论都应谨慎得出。需要进一步的基因组分析来全面了解废水中戊型肝炎病毒的分类多样性，并通过人类调查或捕捉老鼠来评估这种病毒传播的真正风险。从公共卫生的角度来看，在废水中检测到Rocahepevirus ratti突显了环境监测作为早期预警系统的重要性。这些发现支持实施结合环境采样、啮齿动物监测和潜在人类暴露调查的综合“同一健康”监测策略。加强卫生设施和城市啮齿动物控制措施也有助于降低快速发展的城市（如科纳里市）中的动物源性传播风险。

补充材料

相关支持信息可下载于https://www.mdpi.com/article/10.3390/pathogens15040385/s1。补充表S1包含了用于HEV检测的RT-qPCR和嵌套RT-PCR检测的引物序列（5′–3′）、目标区域和参考文献。