《Fermentation》：Green Enzyme Innovation: Improved Laundry Detergent Protease Production Through Solid-State Fermentation
José Juan Buenrostro-Figueroa,
Sergio Huerta-Ochoa,
Cristóbal Noé Aguilar,
María Isabel Reyes-Arreozola,
Francisco José Fernández and
Lilia Arely Prado-Barragán
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为开发更环保高效的洗涤剂，研究人员针对蛋白酶生产可持续性开展研究，通过固体发酵（SSF）技术，利用果蔬副产物作为底物，成功筛选出解脂耶氏酵母（Yarrowia lipolytica, Yl）菌株M17，其生产的蛋白酶提取物在45°C、pH 7.0条件下酶活（43.71 U (g dm)?1）与市售洗涤剂相当。该研究不仅为洗涤剂行业提供了一种绿色酶制剂创新方案，也实现了果蔬废弃物的高值化利用，对推动洗涤剂蛋白酶（protease）的可持续发展和副产物管理具有重要意义。
在现代生活中，洗涤剂是不可或缺的日常用品，其核心清洁成分之一便是蛋白酶（protease）。这些微小的“生物剪刀”能够精准水解蛋白质类污渍，如血渍、汗渍、食物残渣等，让衣物焕然一新。然而，随着全球对环境保护和可持续发展的呼声日益高涨，传统洗涤剂及其酶制剂的生产方式面临着严峻挑战。目前市售洗涤剂蛋白酶主要依赖于大规模液体发酵（Submerged Fermentation, SmF）生产，这个过程通常需要消耗大量的水资源和能源，并且可能产生较多的废水。此外，蛋白酶在洗涤剂中的稳定性和活性容易受到温度、pH值以及洗涤剂中其他化学成分（如表面活性剂）的影响，这限制了其更广泛和高效的应用。另一方面，全球每年产生巨量的果蔬加工副产物，这些废弃物如果处理不当，不仅造成资源浪费，还会带来环境压力。能否将这些“垃圾”变废为宝，同时生产出性能优异、环境友好的洗涤剂用蛋白酶呢？这正是发表于《Fermentation》期刊上的一项研究所要回答的问题。
研究人员开展了一项创新性的探索，旨在将固体发酵（Solid-State Fermentation, SSF）技术与果蔬副产物增值（valorization）相结合，开发适用于洗衣液的高质量蛋白酶。他们从墨西哥城的小型果汁制造商处收集了多种新鲜果蔬副产物（如木瓜、西瓜、黄瓜等），以此为资源，分离筛选能产蛋白酶的微生物菌株。研究采用了包含菌株分离筛选、酶活定性定量测定、发酵培养基优化、化学成分分析以及统计检验在内的关键技术方法。通过将候选菌株在含有脱脂乳的平板上培养，观察其水解圈来初步判断蛋白酶活性；进一步在含有不同浓度市售洗涤剂（如Tide?）的平板上，测试菌株在不同温度下的耐受性和酶活；通过优化以果蔬副产物为基础的发酵培养基的碳氮比（C/N），来提升蛋白酶产量；并利用元素分析等方法表征了底物的化学成分，为培养基设计提供依据。
3.1. 分离和筛选在脱脂乳平板上的蛋白酶生产菌株
研究人员从果蔬副产物中分离出486株菌株，通过在不同温度（30°C和45°C）下的生长情况以及其在脱脂乳平板上的蛋白水解能力（通过水解圈与菌落直径的比值，即效力指数PI来衡量）进行筛选。最终从65株初选菌株中，确定了9株在45°C下具有较高蛋白水解活性的菌株。图示了菌株在平板上产生清晰水解圈的过程。
3.2. 不同洗涤剂浓度（1%、5%、10% v/v）在30°C和45°C下对菌株蛋白酶活性的影响
为了模拟真实洗涤环境，研究测试了这9株菌在含有不同浓度（1%, 5%, 10% v/v）市售洗涤剂（Tide?）的平板上的活性，并分别在30°C和45°C下培养。结果表明，在30°C下，多数菌株在不同浓度洗涤剂中均能表现活性；但在45°C下，只有M7、M17和Sal20A三株菌能保持活性。其中，菌株M17在5%和10%洗涤剂浓度下表现出最高的效力指数（PI），显示出其对洗涤剂成分和较高温度的良好耐受性。展示其活性。
3.3. pH对洗涤剂和蛋白酶提取物中蛋白酶活性的影响
研究评估了pH值（7.0-12.0）对10种市售洗涤剂内源蛋白酶以及所选菌株蛋白酶提取物活性的影响。所有测试的洗涤剂在pH 7.0时表现出最高酶活，随着pH升高活性下降。菌株M17的蛋白酶提取物在pH 7.0和45°C下的活性，与表现最佳的市售洗涤剂Tide?的酶活仅低13.11%，证明其具有与商业产品相媲美的潜力。和清晰对比了不同pH和产品间的活性差异。
3.4. 果蔬副产物及额外碳氮源组分的化学和元素组成
研究分析了所用果蔬副产物以及作为氮源补充的大豆酱的化学成分（蛋白质、脂肪、粗纤维、灰分、水分）和元素组成（碳、氮），并计算了碳氮比（C/N）。这些数据为后续设计发酵培养基提供了关键基础。
3.5. 培养基组成（C/N）对所选菌株蛋白酶生产的影响
研究设计了五种不同碳氮组成的培养基（CM1-CM5），探究碳氮比（C/N）对菌株M17蛋白酶生产的影响。结果显示，蛋白酶的生产高度依赖于培养基的C/N比。当C/N比为20.04（CM2，含有大豆粉和硫酸铵作为氮源）时，在发酵48小时获得了最高的蛋白酶活性，达到43.71 U (g dm)?1。而C/N比过高（如CM5，C/N=66.69）则会完全抑制蛋白酶的生产。在生产率方面，未添加外源氮、C/N为23.83的CM1获得了最高的生产率1.376 U (g dm h)?1。
在讨论部分，研究深入分析了结果。温度被确定为比洗涤剂浓度更能显著影响菌株蛋白酶活性的参数。研究筛选出的最优菌株M17，通过分子鉴定（基于ITS rDNA序列分析）为解脂耶氏酵母（Yarrowia lipolytica, Yl），这是一种被普遍认为安全（GRAS）的微生物，这为其在日化产品中的应用提供了重要的安全优势。相比之下，其他表现良好的菌株M7和Sal20A被鉴定为烟曲霉（Aspergillus fumigatus）和黄曲霉（Aspergillus flavus），属于潜在病原菌，因此未被进一步采用。该研究证明，利用Yl结合果蔬副产物进行固体发酵，是生产高品质洗涤剂蛋白酶的一种实用、环保的方法。
本研究最终得出结论，成功证实了利用固体发酵技术和果蔬加工副产物生产适用于洗涤剂的蛋白酶的可行性。研究筛选出的解脂耶氏酵母菌株Yl (M17)能够产生在家庭洗涤常见条件（如45°C、pH 7.0、存在洗涤剂成分）下保持高活性的蛋白酶，其性能与领先的商业产品相当。通过优化发酵培养基，发现有机氮源与适宜的碳氮比（C/N ≈ 20）能最大程度提升酶产量。这项工作的重要意义在于多方面：首先，它为洗涤剂行业提供了一条可持续的酶制剂生产路径，减少了对传统高耗能发酵方式的依赖；其次，它将果蔬废弃物转化为高附加值产品，推动了循环生物经济和“变废为宝”的实践；最后，所采用的非致病性GRAS微生物和固体发酵工艺，整体上构成了一个环境友好的“绿色酶创新”体系。这项研究不仅为开发下一代高效环保型洗涤剂奠定了坚实的科学基础，也为工业生物技术在废弃物资源化利用方面展示了广阔的应用前景。
