数字压力与电子健康素养如何影响护理服务的缺失以及人们使用人工智能决策支持的意愿 埃米莉亚·克莱（Emilia Clej）、 阿德琳娜·马夫雷亚（Adelina Mavrea）、 卡梅莉亚·菲泽迪安（Camelia Fizedean）、 阿丽娜·多伊娜·塔纳塞（Alina Doina T?nase）、 阿德里安·科斯明·伊利耶（Adrian Cosmin Ilie）和 阿丽娜·蒂舍尔（Alina Tischer）

《Healthcare》：How Digital Stress and eHealth Literacy Relate to Missed Nursing Care and Willingness to Use AI Decision Support Emilia Clej, Adelina Mavrea, Camelia Fizedean, Alina Doina T?nase, Adrian Cosmin Ilie and Alina Tischer

　　**简单摘要**
中国绒螯蟹（Eriocheir sinensis）分布于中国北部和南部，这两个地区的环境条件各不相同。在本研究中，我们比较了这些北部和南部种群肌肉组织与肝胰腺组织的转录组及DNA甲基化特征。我们发现这两种组织在种群层面存在显著差异，并发现某些基因的DNA甲基化变化与表达改变相关。这些结果表明，表观遗传调控可能有助于E. sinensis在不同纬度下的环境适应。我们的发现为该物种的种群分化提供了新的分子机制见解，并确定了未来研究甲壳类动物对复杂环境适应性的潜在候选基因。

**摘要**
中国绒螯蟹（Eriocheir sinensis）广泛分布于中国东部，北部和南部种群可能演化出了不同的环境适应机制。DNA甲基化作为一种重要的表观遗传修饰，在环境适应中起着关键作用。本研究对辽河（LH）和北仑河（BLH）地区的E. sinensis种群进行了RNA-seq和全基因组亚硫酸盐测序（WGBS）分析，分别获得了12个mRNA文库和12个DNA甲基化文库。RNA-seq分析显示，与BLH组相比，LH组的肌肉和肝胰腺中有622个和783个差异表达基因（DEGs），其中下调基因占较大比例。WGBS分析表明，E. sinensis的基因组DNA甲基化主要发生在CG序列中，且基因体区域的甲基化水平最高。肌肉和肝胰腺中分别鉴定出972个和991个差异甲基化区域（DMRs）。综合分析进一步确定了肌肉中的10个差异甲基化和表达基因（DMEGs）以及肝胰腺中的26个DMEGs。值得注意的是，两种组织中的甲基化变化与基因表达变化之间没有固定模式。这些发现表明，DNA甲基化可能通过调节基因表达参与E. sinensis在北部和南部种群中的环境适应。我们的结果强调了表观遗传调控在甲壳类动物对不同环境进化适应中的重要作用，并为开发与环境相关的分子标记物及评估适应性种质资源提供了理论基础。

**1. 引言**
复杂的环境条件，尤其是温度，是影响变温水生生物生长、发育、繁殖和分布的关键因素，对其生理适应性有显著影响[1]。变温无脊椎动物特别容易受到气候变化和栖息地温度等因素的影响[2,3]。环境波动会扰乱细胞活动，对水生动物的生存和生长产生重大影响[4]。广温性水生生物具有广泛的环境耐受范围，并表现出与其特定局部温度环境密切相关的种群适应性机制[5]。因此，生活在不同纬度的种群可能具有可遗传的表型分化或转录调控机制以应对选择压力。纬度影响水生动物的生长速率、基础代谢率和繁殖投入[6,7]。研究表明，生活在低纬度的Cerastoderma edule主要将能量用于生殖发育，几乎全年都在产卵，导致生长缓慢且体型较小[8]。高纬度的海洋草食性黄鱼（Odax pullus）和肉食性带纹鲷（Notolabrus fucicola）种群虽然生长速度较慢，但最终体型比低纬度种群更大[9]。肌肉组织是水生动物的主要可食用部分，具有重要的经济价值。北方对虾（Litopenaeus vannamei）的肌肉组织在高温下能有效生成和供应用于热休克蛋白合成的能量[10]。肝胰腺作为甲壳类动物的核心代谢器官和能量储存中心，在热应激期间起着关键调控作用。中国绒螯蟹（Eriocheir sinensis）是中国最重要的淡水养殖甲壳类动物之一，年产量超过80万吨，具有巨大的商业价值。由于其广温性和广盐性特征，它也是研究环境适应遗传机制的理想模式生物。在中国，根据纬度将E. sinensis种群分为北部和南部两组，北部种群包括辽河、黄河、长江和瓯江流域的螃蟹，南部种群包括珠江、北仑河和南柳河流域的螃蟹[11]。辽河冬季水温可降至0°C[12]，而北仑河冬季水温保持在14°C以上[13]。目前的研究主要采用基础遗传学和形态学方法，对不同地区河流蟹的种群遗传结构和环境适应性提供了有限的认识[11,14,15]。这些方法无法完全解释北部和南部种群在环境适应性和形态行为特征上的差异。需要通过基因表达和表观遗传调控进一步探索和分析。

表观遗传介导的表型可塑性是物种应对环境变化和快速气候变化的主要机制[16]。研究表明，DNA甲基化作为一种表观遗传修饰，在物种环境适应中起着关键作用。例如，Platt等人[17]在拟南芥自然种群中发现DNA甲基化与增强的局部环境适应密切相关。Gao等人[18]证明DNA甲基化在大黄鱼（Larimichthys crocea）的缺氧调节中起重要作用。Gao等人[19]揭示DNA甲基化通过调节基因表达参与游泳蟹（Portunus trituberculatus）的低盐度适应机制。Huang等人[20]表明，通过DNA甲基化调节血管收缩和能量代谢，遗传改良的罗非鱼（Oreochromis niloticus）能够适应高盐度压力。然而，表观遗传修饰（如DNA甲基化）在E. sinensis自然种群中的环境适应作用仍需进一步研究。因此，为了阐明北部和南部种群之间适应性差异的表观遗传机制，本研究采用全基因组亚硫酸盐测序（WGBS）和RNA-seq分析了不同纬度和环境下的E. sinensis表观遗传机制。这些发现将为E. sinensis的遗传育种和种质创新提供重要的遗传学基础。

**2. 材料与方法**
**2.1 动物和组织采集**
2023年10月，从辽河（LH）和北仑河（BLH）种群中随机选取了6只野生捕获的螃蟹。中国东部海岸两个采样点的精确地理位置如图1所示。根据10月份的区域背景记录，LH地区的平均水温约为12°C，盐度为0.5 ppt；BLH地区的平均水温约为26°C，盐度为1.2 ppt。在采集组织之前，仔细测量了包括性别、体长、体宽、体厚和体重在内的关键生物参数。LH和BLH组中的性别比例均为3只雌性和3只雄性。具体参数如下：
- BLH组：雌性体长45.96 ± 2.48 cm，体宽49.29 ± 1.97 cm，体厚22.53 ± 1.58 cm，体重51.47 ± 7.54 g；
- 雄性体长43.75 ± 1.34 cm，体宽46.22 ± 1.89 cm，体厚22.38 ± 0.71 cm，体重53.18 ± 3.43 g；
- LH组：雌性体长44.04 ± 2.40 cm，体宽47.61 ± 2.45 cm，体厚23.81 ± 0.95 cm，体重51.05 ± 7.57 g；
- 雄性体长43.07 ± 1.90 cm，体宽47.06 ± 2.01 cm，体厚22.42 ± 1.43 cm，体重50.95 ± 6.60 g。所有12只螃蟹的详细生物参数见表1。

**2.2 mRNA文库构建与测序**
使用Trizol试剂（Invitrogen，美国加利福尼亚州卡尔斯巴德）按照制造商的标准协议从LH和BLH种群的野生捕获E. sinensis的肝胰腺和肌肉组织中提取总RNA（每组6个样本）。首先将组织在试剂中匀浆，然后用氯仿进行相分离，接着用异丙醇沉淀和75%乙醇洗涤。然后将同一组中两个样本的RNA混合用于测序，每组进行3次生物学重复。以肝胰腺为例，制备了6个RNA-seq文库（LH_L_1、LH_L_2、LH_L_3、BLH_L_1、BLH_L_2和BLH_L_3）。肌肉组织的处理方法相同，生成相应的文库。使用Agilent 5400系统（Agilent，美国加利福尼亚州圣克拉拉）和NanoDrop Lite分光光度计（NanoDrop Technologies，美国特拉华州威尔明顿）评估总RNA的质量。

为了获得高质量RNA，按照Illumina的指南使用RNA Library Prep Kit（Illumina，美国加利福尼亚州圣地亚哥）制备mRNA测序文库。首先去除核糖体RNA，然后用乙醇沉淀纯化剩余物质。纯化的RNA被切割成短片段，作为逆转录酶合成第一链cDNA的模板。随后合成第二链cDNA以生成双链cDNA。经过末端修复、A尾添加和接头连接后，使用接头特异性引物进行PCR扩增，以富集两端带有测序接头的cDNA片段。扩增产物经过纯化和大小选择后，构建最终的cDNA文库。根据文库质量和数量要求，在Illumina平台（Illumina，美国加利福尼亚州圣地亚哥）上使用配对末端150 bp（PE150）策略进行测序。

**2.3 生物信息学处理和转录组数据分析**
对原始测序读段进行处理，去除接头序列、碱基不确定度超过5%的读段和低质量读段，生成高质量的数据。计算Q20和Q30等质量指标以确保测序可靠性。然后使用HISAT2软件（v.2.2.1）将有效的清洁读段与Eriocheir sinensis参考基因组对齐，以便后续分析。使用StringTie（v.2.1.4）分别组装每个样本的转录组，并使用“-merge”功能将它们合并。使用Gffcompare（v.0.12.1）将新生成的转录组与已知参考注释进行比较和注释。使用Fragments Per Kilobase of transcript per Million mapped reads（FPKM）指标量化并标准化基因的转录表达水平。使用R语言（v3.12.1）中的edgeR包进行LH和BLH组之间的差异表达分析。符合严格标准的基因（调整后的p值< 0.05，|log2(FoldChange)| > 1，FPKM > 10）被定义为差异表达基因（DEGs）。最后，通过Gene Ontology（GO）和Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes（KEGG）进行功能富集分析，显著性阈值设为p值< 0.05。

**2.4 DNA甲基化文库构建与测序**
使用与RNA-seq相同的螃蟹个体构建全基因组亚硫酸盐测序（WGBS）文库。使用DNeasy Tissue Kit（Qiagen，德国希伦）从LH和BLH种群的野生捕获E. sinensis的肝胰腺和肌肉组织中提取基因组DNA（每组6个样本）。通过琼脂糖凝胶电泳、Qubit? DNA Assay Kit（Qubit? 2.0 Fluorometer，Life Technologies，美国加利福尼亚州卡尔斯巴德）和NanoDrop Lite分光光度计（NanoDrop Technologies，美国特拉华州威尔明顿）评估DNA的完整性、浓度和纯度。为了与RNA-seq设计保持一致，每组中两个样本的基因组DNA混合用于文库构建，每个池中包含一只雌性和一只雄性，每组进行3次生物学重复。以肝胰腺为例，制备了6个WGBS文库：LH_L_1、LH_L_2、LH_L_3、BLH_L_1、BLH_L_2和BLH_L_3。肌肉组织的处理方法相同，生成相应的文库。将100 ng的基因组DNA和0.5 ng的lambda DNA混合后，使用Covaris S220（Covaris公司，美国马萨诸塞州沃本市）柱子进行片段化处理。片段化的DNA随后经过末端修复、3′-腺苷酸化以及甲基化适配子的连接，之后对连接了适配子的DNA片段进行纯化。接着使用EZ DNA Methylation-GoldTM试剂盒（Zymo Research公司，美国加利福尼亚州尔湾市）进行亚硫酸氢盐转化和PCR扩增。全基因组甲基化测序使用Illumina Nova平台（Illumina公司，美国加利福尼亚州圣地亚哥市）以150 bp的双端模式进行。

2.5. 甲基化计算和差异甲基化分析
使用Bismark（v0.25.1）将全基因组甲基化测序的清洁读段映射到E. sinensis基因组上。使用Bismark Methylation Extractor提取甲基化胞嘧啶位点，并保留至少在所有生物重复样本中重复三次的保守胞嘧啶位点，然后导入R包methyKit（v.0.99.2）[21]中进行差异甲基化分析。甲基化水平定义为mC读段数/C读段数。通过1000 bp的窗口和1000 bp的步长来识别差异甲基化区域（DMRs）。在LH组中显示出显著更高甲基化水平的区域被定义为高甲基化（hyper）DMRs，而甲基化水平较低的区域被定义为低甲基化（hypo）DMRs。此外，根据参考基因组注释，DMRs按其位置分为上游（启动子）、外显子、内含子、基因体、下游和基因间区域。显著性阈值设定为q < 0.01且差异百分比 > 20%。使用Bedtools对DMRs内的基因和基因组元件进行注释。最后，分别使用GOseq R包（v.1.50.0）[22]和KEGK软件（v.3.0）[23]进行GO和KEGG富集分析。

2.6. 基因组甲基化和转录组改变的联合分析
在获得DMGs后，我们使用自定义脚本将它们与从转录组中得到的DEGs进行比较，以识别差异表达的差异甲基化基因（DMEGs）并探索它们的功能作用。

2.7. 实验验证
为了进行qRT-PCR验证，从肌肉和肝胰腺组织中选择了5个DEGs进行实验验证。表S1显示了引物序列。使用Mir-X ? miRNA First-Strand Synthesis Reverse Transcription试剂盒（TaKaRa公司，中国大连市）进行miRNA的反转录。引物由Sangon Biotech（中国上海有限公司）合成。miRNA qPCR扩增的反应体系包含2 × TB Green Advantage Premix（TaKaRa），12.5 μL；miR特异性引物（10 μM），0.5 μL；miRQ 3’引物（10 μM），0.5 μL；cDNA，2 μL；以及H2O，9.5 μL。每个样本测量三次，以U6作为参考基因。使用CFX96实时PCR检测系统（Bio-Rad公司，美国加利福尼亚州赫拉克勒斯市）进行测量，反应程序参考之前的研究[24]。
mRNA和lncRNA的qRT-PCR方法简要描述如下：分别使用PrimeScriptTM RT试剂盒（TaKaRa公司，中国大连市）和gDNA Eraser以及TB Green Premix Ex TaqTM‖（TaKaRa公司，中国大连市）进行反转录和RT-PCR。参考基因为β-actin。相对表达水平使用2?ΔΔct方法计算[25]。

3. 结果
3.1. 北部和南部群体的测序数据概述
对来自LH和BLH群体的E. sinensis的肝胰腺和肌肉组织进行了RNA-seq和WGBS分析。总共构建了12个mRNA文库和12个WGBS甲基化文库，包括LH_M1_1、LH_M1_2、LH_M1_3、LH_L_1、LH_L_2、LH_L_3、BLH_M_1、BLH_M_2、BLH_M_3、BLH_L_1和BLH_L_2、BLH_L_3。
对于RNA-seq，共生成了532,101,710个原始读段，每个样本平均44,341,809个原始读段。经过质量控制后，保留了524,483,678个清洁读段，每个样本平均43,706,973个清洁读段，用于后续分析。所有样本的Q20值均高于96.74%，Q30值均高于91%。将清洁读段映射到E. sinensis参考基因组后，样本的平均映射率为76.03%（范围从58.37%到82.99%），表明测序质量和映射性能良好（表S2）。
对于WGBS，共生成了2,006,616,194个原始读段，每个样本平均167,218,016个原始读段。经过质量控制和去重后，保留了458,222,531个清洁读段，每个样本平均38,185,211个清洁读段。将清洁读段映射到E. sinensis参考基因组后，所有样本的映射率范围从20.69%到26.67%（表S3）。

3.2. RNA-seq的差异表达分析
在12个mRNA文库中，调整后的p值< 0.05、log2|FC| > 1且FPKM > 10的基因被识别为DEGs。在肌肉组织中，LH组与BLH组相比共检测到622个DEGs，其中432个基因下调，190个基因上调，下调基因的数量显著多于上调基因。在肝胰腺组织中，LH组相对于BLH组共识别出783个DEGs，包括472个下调基因和311个上调基因（图2）。
图2. mRNA的差异表达分析。(A) LH组与BLH组肌肉中的DE mRNA火山图；(B) LH组与BLH组肝胰腺中的DE mRNA火山图。

3.3. DEGs的KEGG和GO富集分析
KEGG富集分析显示，在肌肉组织中，共识别出23个显著富集的KEGG通路（图3A），图中展示了前20个通路。最显著富集的通路是核糖体，这是蛋白质合成的关键通路。此外，在免疫相关、代谢相关和凋亡相关通路中也观察到富集，包括抗原处理和呈递、胰腺分泌、凋亡、蛋白质消化和吸收以及MAPK信号通路。在肝胰腺组织中，共识别出18个显著富集的KEGG通路（图3C），主要涉及免疫相关和代谢相关通路，如溶酶体、抗原处理和呈递、凋亡以及代谢通路，包括氨基酸代谢和类固醇生物合成（图3）。
图3. LH组与BLH组DEGs的KEGG和GO富集分析。(A) 肌肉中前20个富集的KEGG通路；(B) 肌肉中三个类别的前10个GO术语；(C) 肝胰腺中前20个富集的KEGG通路；(D) 肝胰腺中三个类别的前10个GO术语。GO富集分析显示，DEGs主要富集在三个主要类别：细胞组分、分子功能和生物过程。每个类别的前10个术语显示在图3B和D中。在肌肉组织中，DEGs在细胞质核糖体中富集最显著，其次是核糖体。在肝胰腺组织中，DEGs在氧化还原酶活性中富集最显著，其次是铁离子结合和催化活性。

3.4. 差异甲基化区域分析
对所有甲基化测序样本的聚类分析显示，根据地理来源，12个样本首先被分为两个明显的主要分支LH和BLH。在每个群体分支内，肌肉和肝胰腺组织没有形成明显的组织特异性亚群（图4A）。样本间关系的PCA分析显示，基于地理来源在PC1轴上有明显的分离（图4B），表明北部和南部群体之间的甲基化差异远大于肝胰腺和肌肉组织之间的差异。

3.5. KEGG和GO富集分析
对从DMRs中注释的DMGs进行了KEGG和GO富集分析。KEGG富集分析显示，在肌肉组织中，共识别出23个显著富集的KEGG通路（图3A），图中展示了前20个通路。最显著富集的通路是核糖体，这是蛋白质合成的关键通路。此外，在免疫相关、代谢相关和凋亡相关通路中也观察到富集，包括抗原处理和呈递、胰腺分泌、凋亡、蛋白质消化和吸收以及MAPK信号通路。在肝胰腺组织中，共识别出18个显著富集的KEGG通路（图3C），主要涉及免疫相关和代谢相关通路，如溶酶体、抗原处理和呈递、凋亡以及吞噬体，以及代谢通路，包括氨基酸代谢和类固醇生物合成（图3）。
图3. LH组与BLH组DEGs的KEGG和GO富集分析。(A) 肌肉中前20个富集的KEGG通路；(B) 肌肉中三个类别的前10个GO术语；(C) 肝胰腺中前20个富集的KEGG通路；(D) 肝胰腺中三个类别的前10个GO术语。GO富集分析显示，DEGs主要富集在三个主要类别：细胞组分、分子功能和生物过程。每个类别的前10个术语显示在图3B和D中。在肌肉组织中，DEGs在细胞质核糖体中富集最显著，其次是核糖体。在肝胰腺组织中，DEGs在氧化还原酶活性中富集最显著，其次是铁离子结合和催化活性。

3.4. 差异甲基化区域分析
对所有甲基化测序样本的聚类分析显示，12个样本首先根据地理来源分为两个明显的主要分支LH和BLH。在每个群体分支内，肌肉和肝胰腺组织没有形成明显的组织特异性亚群（图4A）。样本间关系的PCA分析显示，基于地理来源在PC1轴上有明显的分离（图4B），表明北部和南部群体之间的甲基化差异远大于肝胰腺和肌肉组织之间的差异。

3.5. KEGG和GO富集分析
对从DMRs中注释的DMGs进行了KEGG和GO富集分析。KEGG富集分析显示，在肌肉组织中，心肌细胞中的肾上腺素能信号通路是最显著富集的通路。此外，信号调节通路如MAPK信号通路和胰岛素信号通路也显著富集（图6A）。在肝胰腺组织中，DMGs主要富集在信号转导、代谢和细胞过程调节相关的通路中，如轴突再生、胆固醇代谢和MAPK信号通路（图6C）。
图6. LH组与BLH组DMGs的KEGG和GO富集分析。(A) 肌肉中前20个富集的KEGG通路；(B) 肌肉中三个类别的前10个GO术语；(C) 肝胰腺中前20个富集的KEGG通路；(D) 肝胰腺中三个类别的前10个GO术语。GO富集分析显示，DMGs主要富集在三个主要类别：细胞组分、分子功能和生物过程，每个类别的前10个术语显示在图6B和D中。在肌肉组织中，DEGs在发育生长调节中富集最显著，其次是定位建立和细胞质部分（图6B）。在肝胰腺组织中，DMGs主要在MF类别中富集，如小GTP酶结合、ras GTP酶结合和蛋白质结合（图6D）。

3.6. 全基因组DNA甲基化和转录组数据的综合分析
通过分析DMGs和DEGs之间的重叠，我们识别出与DMRs相关的DEGs。在LH组和BLH组的肌肉组织中，共识别出11个DMEGs，包括2个低甲基化/上调的DMEGs、4个高甲基化/上调的DMEGs、3个低甲基化/下调的DMEGs和2个高甲基化/下调的DMEGs。在肝胰腺组织中，共识别出26个DMEGs，包括5个低甲基化/上调的DMEGs、9个高甲基化/上调的DMEGs、9个低甲基化/下调的DMEGs和3个高甲基化/下调的DMEGs（图7）。在这些DMEGs中，肌肉中的NESPRIN-1和SLC22A4表现出高甲基化伴随下调表达，而ATP1A和CLCA2的表达上调。在肝胰腺中，CAT和HAGO2在LH组中下调，而ABCC4、HECW2和ANKIB1上调。所有识别出的DMEGs的详细信息，包括它们的甲基化和表达变化，提供在表S4中。在这些DMEGs中，肌肉中的NESPRIN-1和SLC22A4表现出高甲基化伴随下调表达。ATP1A也表现出甲基化状态改变以及下调表达，而CLCA2在LH组中表现出低甲基化伴随下调表达。在肝胰腺组织中，CAT和HAGO2在LH组中表现出高甲基化伴随下调表达，而ABCC4、HECW2和ANKIB1表现出高甲基化伴随上调表达。所有识别出的DMEGs的详细信息，包括它们在每个组织中的甲基化和表达变化模式，提供在表S4中。
图7.结合全基因组甲基化和转录组分析。(A) 肌肉；(B) 肝胰腺。3.7. qRT-PCR验证差异表达基因(DEGs)为了验证转录组数据的可靠性，选择了来自肌肉组织的5个DEGs（TUBA1D、MTFP1、MYHC、TNC和HSC70）和来自肝胰腺组织的5个DEGs（GPX、CYB5、AGMO、CEOCT1和UGT2B14）进行实验验证。测序结果和qRT-PCR验证结果在肌肉（图8A）和肝胰腺（图8B）组织中都非常一致。图8. 通过qRT-PCR确认从RNA-Seq中鉴定出的10个基因的差异表达。(A) 比较肌肉组织中5个选定基因的log2（倍数变化）值与qRT-PCR的结果。(B) 比较肝胰腺组织中5个选定基因的log2（倍数变化）值与qRT-PCR的结果。4. 讨论在水生动物中，成功适应环境变化不仅取决于基因序列的变化，还取决于动态的分子调控机制。最近的研究表明，转录调控和表观遗传修饰可以在不改变基础基因序列的情况下影响基因表达和表型可塑性，从而在物种适应环境条件中发挥重要作用[26]。作为最经典和被广泛研究的表观遗传标记之一，DNA甲基化可以通过调节相关基因的转录活性和染色质状态来参与生物体对温度、盐度和酸碱条件的响应[27,28,29,30]。中华绒螯蟹广泛分布在中国东部地区，从北到南，LH和BLH种群长期暴露于不同的环境背景下，这可能导致不同的适应策略。基于此，本研究使用RNA-seq和WGBS来探讨北方和南方中华绒螯蟹种群在转录和表观遗传水平上的差异。全基因组胞嘧啶甲基化水平在不同物种间存在显著差异。先前的研究表明，节肢动物的整体胞嘧啶甲基化水平通常较低，一般在0%到1%之间[31,32]，而鱼类、家禽和哺乳动物的甲基化水平通常在3-10%左右[33,34,35,36]。相比之下，高等植物的甲基化水平可高达30%[37]。在之前关于中华绒螯蟹性别相关甲基化的研究中，甲基化水平约为2.6-4.5%[38]。在本研究中，中华绒螯蟹的平均甲基化水平约为4%，与此处报告的结果相似，高于游泳蟹的1.0-1.5%[19]和太平洋白虾（Litopenaeus vannamei）的1.2%[39]。这些发现表明，甲基化水平的差异可能与物种、种群或环境背景有关。从序列背景的角度来看，动物中的DNA甲基化主要由CpG（CG）位点主导[40]，而非CpG甲基化（CHG和CHH）通常发生在较低水平。在鱼类中，CG甲基化占三种甲基化类型（CG、CHG和CHH）的90%以上[41]。与此模式一致，本研究中的中华绒螯蟹甲基化主要发生在CG背景下，而CHG和CHH背景下的甲基化水平较低，这与太平洋白虾的研究结果一致[39]。同时，我们的结果显示，在基因组功能区域层面，差异甲基化区域在基因体（包括外显子和内含子）中最丰富，其次是下游区域，最少在上游区域。在无脊椎动物中，基因体CG甲基化通常与转录稳定性维持、表达抑制和可变剪接有关，因此可能与适应不同环境有关[42]。从功能角度来看，肌肉是能量消耗和运动活动的主要组织[43]，而肝胰腺在甲壳类动物的消化、能量代谢和免疫反应中起核心作用[44]。转录组数据显示，与BLH种群相比，LH种群在肌肉和肝胰腺组织中下调的基因多于上调的基因，表明整体上存在转录抑制的趋势。这种表达模式可能与北方和南方栖息地长期环境分化下的生理功能调节有关[45]。在水生动物中，整合的甲基组和转录组研究表明，包括盐度和其他栖息地相关因素在内的不同环境条件可以以组织特异性的方式重塑基因表达和表观遗传状态[39,46]。因此，这里观察到的组织特异性转录差异可能反映了LH和BLH种群之间不同的适应调控策略。为了识别与两个种群之间环境差异调节相关的候选基因，我们对DMGs和DEGs进行了综合分析，分别在肌肉和肝胰腺组织中鉴定出11个和26个DMEGs。先前的研究通常表明，启动子和转录起始位点附近区域DNA甲基化的增加通常与转录抑制相关[47]。然而，在水稻（Oryza sativa）和苹果（Malus domestica）等物种中的研究也表明，基因体甲基化可以与基因表达水平呈正相关[48,49]。与这些发现一致，我们在本研究中观察到，不同基因和不同基因组区域的甲基化变化导致了不同的转录反应，没有单一的统一调控模式。这些结果表明，在不同纬度环境下的DNA甲基化与基因表达之间的关系是复杂的，可能受到多种因素的共同影响，包括甲基化的基因组位置、甲基化类型、甲基化变化的幅度以及组织/细胞组成和染色质状态。在甲壳类动物中，生长、运动和进食等行为依赖于肌肉组织的能量输出，肌肉收缩和神经肌肉传递效率对环境变化非常敏感[50,51]。在肌肉组织中，鉴定出的DMEGs与肌肉结构、离子运输和代谢调节途径相关。NESPRIN-1是LINC复合体的核心成分之一，连接细胞核和细胞骨架，并参与肌核定位和机械转导[52]。其在LH中的高甲基化和表达降低表明，在不同的环境背景下核-细胞骨架耦合和肌肉结构重塑发生了变化。肌肉收缩依赖于动作电位介导的兴奋-收缩耦合[53,54]。ATP1A和CLCA2分别编码Na+/K+-ATP酶α亚基和氯通道辅助/调节因子[55,56]。它们在LH中的上调表明离子运输和膜稳态得到加强，这可能有助于维持肌肉兴奋性。此外，SLC22A4是一种有机阳离子转运蛋白，能够运输肉碱和麦角硫因等小分子底物[57]。其在LH中的高甲基化和下调可能表明特定代谢底物的运输减少。两个种群之间肌肉组织中显著DEGs的功能进一步细化了这一解释。TUBA1D是一种α-微管蛋白家族基因，与微管组织和细胞骨架动态密切相关[58]，其上调与LH肌肉中的活跃结构重塑一致。MTFP1参与线粒体动态和生物能量稳态[59]，表明线粒体调节也可能在两个种群之间存在差异。相比之下，MYHC和TNC分别编码收缩机制的核心成分和肌钙蛋白复合体的Ca2+传感器[60,61]，在LH中下调，表明在收缩相关功能上的投资减少。HSC70是一种重要的分子伴侣蛋白，参与蛋白质折叠和蛋白质稳态[62]，其下调进一步表明肌肉中的蛋白质质量控制发生了变化。总的来说，DMEGs和qRT-PCR验证的基因表明，两个种群之间的肌肉差异主要涉及在对比环境背景下细胞骨架组织、离子稳态、线粒体动态和收缩活动的协调调整。甲壳类动物的肝胰腺在消化、营养代谢、免疫防御和内部稳态维持中起核心作用，因此被广泛认为是参与环境适应的关键器官[10,63]。鉴定出的DMEGs表明，LH和BLH之间的差异主要涉及肝胰腺中的抗氧化调节、跨膜运输、蛋白质周转和转录后控制。过氧化氢酶（CAT）是一种关键的抗氧化酶，负责消除H2O2，在甲壳类动物的环境适应研究中常用作氧化应激的指标[64]。在本研究中，LH种群中的CAT显示低甲基化伴随表达下调，表明中华绒螯蟹在不同环境下可能采用不同的抗氧化策略。ABCC4是一种ABC转运蛋白，参与有机阴离子和信号分子的排出[65]，而CLCN2与氯离子运输和离子稳态相关。它们在LH中的上调表明跨膜运输和稳态调节得到加强。HECW2和ANKIB1都与泛素依赖的蛋白质周转有关[66,67]，表明蛋白质质量控制可能存在差异。此外，关于转录后调节，HAGO2是miRNA介导的基因沉默和转录后调节的核心成分[68]，其下调表明LH肝胰腺中的RNA介导的调节活性发生了变化。转录组结果中显著DEGs的功能进一步细化了这一解释。GPX是一种主要的依赖谷胱甘肽的抗氧化酶，可减少过氧化物[69]，其上调表明抗氧化防御增强。CYB5参与脂肪酸去饱和、固醇代谢和微粒体氧化还原反应[70]，而AGMO是醚脂质代谢的关键酶[71]；它们的表达增加表明脂质相关代谢和氧化还原调节发生了变化。相比之下，CEOCT1是一种OCT1样转运蛋白，与有机阳离子吸收有关[72]，UGT2B14属于UDP-葡萄糖醛酸转移酶家族，催化对解毒重要的葡萄糖醛酸化反应[73]。它们的下调表明底物吸收和代谢处理减少。总体而言，DMEGs和验证的DEGs表明，两个种群之间的肝胰腺差异主要涉及在对比环境背景下抗氧化能力、运输过程、蛋白质稳态和代谢解毒的协调重塑。此外，尽管本研究强调了DNA甲基化在环境适应中的潜在作用，但LH和BLH种群之间观察到的DNA甲基化和基因表达差异可能不仅仅是由环境相关调节驱动的[74]。北方和南方种群之间的长期地理分离也可能导致了遗传背景的差异[75]。这种遗传变异，包括SNPs和结构变异，可能通过调节效应（例如meQTLs或eQTLs）影响甲基化和基因表达模式。此外，由于本研究基于两个自然种群的比较而不是控制环境实验，当前的设计无法将温度或其他特定环境变量的影响与种群特异性背景差异区分开来。未来将全基因组重测序与表观基因组和转录组数据相结合的研究，理想情况下在共同花园和控制环境设计下进行，将有助于澄清遗传背景和环境相关表观遗传变异在中华绒螯蟹中的相对贡献。5. 结论总体而言，本研究系统地研究了北方（LH）和南方（BLH）中华绒螯蟹种群在DNA甲基化和转录水平上的环境适应机制。综合分析进一步鉴定了DMEGs：肌肉组织中的主要参与结构维持和离子稳态，而肝胰腺组织中的主要与抗氧化能力、离子运输和蛋白质稳态相关。这些发现为理解北方和南方种群在纬度环境适应过程中基因表达和DNA甲基化之间的复杂调控网络提供了初步框架，并为后续的功能验证和关键候选基因的进一步研究提供了重要基础。补充材料以下支持信息可在以下链接下载：https://www.mdpi.com/article/10.3390/ani16081164/s1：表S1. 中华绒螯蟹LH和BLH组mRNA文库的数据处理总结。表S2. 中华绒螯蟹LH和BLH组DNA甲基化文库的数据处理总结。表S3. DEMGs总结。表S4. DEMGs总结。