《Biochemical and Biophysical Research Communications》：A novel engineered malonyl-CoA synthetase from Astragalus mongholicus with improved catalytic performance
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蒙古黄耆中AmMatB的发现及其通过截短N端信号肽提升催化效率，结合结构生物学解析关键氨基酸残基，为生物催化提供高效工具。
Jian Chen|Yaxuan Guo|Yaru Yan|Zhenyu Li
山西中医药大学太行药材研究所，晋中市，030600，中国
摘要
丙二酰辅酶A（malonyl-CoA）是许多活性天然产物生物合成的关键前体。丙二酰辅酶A合成酶（MatBs）能够直接将丙二酸（malonic acid）和辅酶A（CoA）转化为丙二酰辅酶A。然而，具有高催化效率的植物MatBs数量有限，这限制了它们在生物催化中的应用。在本研究中，我们从Astragalus mongholicus中鉴定出一种新的丙二酰辅酶A合成酶AmMatB。生化实验证实，重组AmMatB可以直接催化丙二酸和辅酶A生成丙二酰辅酶A，同时也能接受甲基丙二酸（methylmalonate）作为底物。为了提高其实用性，我们设计了一种缺失预测的N端线粒体转运肽的截短变体。这一改造显著提高了催化效率，使丙二酸的Km值从317 μM降低到182.5 μM。此外，同源建模、分子对接和定点突变研究揭示了C212、V218、F241、R277、S307和K524残基在底物结合和产物稳定中的关键作用。本研究不仅提供了一种高效的工程化酶用于丙二酰辅酶A的生产，还为合理设计用于生物催化的植物MatBs提供了新的结构见解。
引言
丙二酰辅酶A（malonyl-CoA）是合成多种天然产物的不可或缺的前体，包括黄酮类[1]、花青素[2]、芪类[3]、聚酮类[4]以及许多丙二酰化化合物[5]。黄酮类作为广泛分布的植物天然产物，具有多种生物活性，如抗氧化、抗炎和抗癌作用[6]、[7]、[8]。在黄酮类的生物合成途径中，丙二酰辅酶A作为聚酮链的二元碳扩展单元[1]。此外，丙二酰辅酶A还作为酰基供体参与丙二酰化化合物的生成[5]，例如丙二酰人参皂苷（malonyl ginsenosides），这些化合物在2型糖尿病的治疗中起着重要作用[9]。
在大多数生物体中，丙二酰辅酶A主要由乙酰辅酶A（acetyl-CoA）通过乙酰辅酶A羧化酶（ACC）合成[10]、[11]。然而，在某些植物[12]、[13]、细菌[14]、[15]、[16]、[17]和人类[18]中也发现了由丙二酰辅酶A合成酶（MatB）介导的替代途径。这种酶可以直接将丙二酸和辅酶A转化为丙二酰辅酶A。MatB属于酰基活化酶（AAE）超家族，通过保守的两步机制催化ATP依赖的反应。首先，羧酸底物被ATP腺苷化，形成酰基-AMP中间体并释放焦磷酸。随后，辅酶A的硫醇基团对酰基-AMP进行亲核攻击，生成酰基辅酶A硫酯和AMP[19]、[20]。该超家族包含一个高度保守的12个氨基酸的AMP结合基序（PROSITE PS00455），常用于识别编码AAE的基因。第一个真核生物MatB AAE13是在拟南芥（Arabidopsis thaliana）中发现的，对丙二酸具有高度特异性，在植物生长发育中起重要作用[12]。其在酵母中的异源表达提高了脂质和天然产物白藜芦醇（resveratrol）的产量[4]。在矮牵牛（petunia）中，AAE13的同源物PhAAE13被证明对花青素生物合成中的丙二酰辅酶A供应至关重要[13]。植物MatBs的实际应用示例是一个“一锅”级联系统，其中AtAAE13与来自不同植物的丙二酰转移酶结合，有效合成了多种丙二酰化糖苷，而无需使用昂贵的丙二酰辅酶A[5]、[21]。尽管AtAAE13和PhAAE13已被鉴定，但由于它们的催化效率不高且缺乏结构-功能研究，植物MatBs在酶促合成中的应用仍然有限。
Astragalus membranaceus（Fisch.）或A. membranaceus（Fisch.）var. mongholicus（Bge.）Hsiao的干燥根（Astragali Radix，黄芪）是一种富含黄酮类和皂苷代谢产物的传统药用草本植物[22]。其中，丙二酰化黄酮糖苷和丙二酰化皂苷也是重要的成分[23]、[24]、[25]。在本研究中，我们从A. mongholicus中鉴定出了AmMatB。体外实验表明AmMatB能够催化丙二酸和辅酶A生成丙二酰辅酶A。重要的是，我们发现截短其N端的53个残基线粒体靶向前序列不仅提高了表达水平，还从根本上改变了其动力学特性。通过分子对接和定点突变研究了对该酶功能至关重要的氨基酸残基。我们的研究提供了一种新的高效真核生物丙二酰辅酶A合成酶，有助于其在生物催化中的应用。
植物材料和化学品
A. mongholicus植物采自甘肃省民县。新鲜植物采集后迅速分离根部，然后置于液氮中冷冻并在-80°C下保存以提取总RNA。标准辅酶A、丙二酸和ATP购自云南生物科技有限公司（上海，中国）。丙二酰辅酶A购自Sigma-Aldrich（德国达姆施塔特）。
分子克隆和序列分析
利用我们之前发表的A. mongholicus转录组数据[23]，我们对AmMatB基因进行了
从A. mongholicus中鉴定和序列分析AmMatB
基于我们团队之前发表的转录组数据[23]，筛选出一个被标注为丙二酰辅酶A合成酶的MatB基因。通过RT-PCR从A. mongholicus cDNA中克隆了AmMatB基因的全长序列。AmMatB包含一个1776 bp的开放阅读框，编码一个预测的591个氨基酸的蛋白质，分子量为64.9 kDa。
对AmMatB和其他酰基活化酶（AAEs）的系统发育分析显示，这些序列共分为七个
结论
在本研究中，我们从A. mongholicus中鉴定并表征了一种新的丙二酰辅酶A合成酶AmMatB。功能实验证实了其能够将丙二酸和辅酶A转化为丙二酰辅酶A。此外，AmMatB还对甲基丙二酸具有催化活性，从而能够生成甲基丙二酰辅酶A。通过去除N端的53个残基前序列，构建了截短变体AmMatB-tr，显著提高了催化效率
利益冲突声明
作者声明他们没有已知的可能会影响本文所述工作的竞争性财务利益或个人关系。
CRediT作者贡献声明
Yaxuan Guo：正式分析。yaru yan：写作——审稿与编辑、监督、资金获取。Jian Chen：写作——初稿撰写、研究、正式分析、数据管理。Zhenyu Li：写作——审稿与编辑、监督、概念构思
利益冲突声明
? 作者声明他们没有已知的可能会影响本文所述工作的竞争性财务利益或个人关系。
致谢
本工作得到了山西省基础研究计划[资助编号 202303021212242]、山西中医药大学的关键发展项目[资助编号2024PY-NS-028]、山西中医药大学优秀博士生研究启动基金[项目编号 2023BKS22]、SXTCM博士青年学者科学研究基金[资助编号2023BK19]以及中医生命组学与创新药物重点实验室的支持
