甲醇驱动毕赤酵母高效合成琥珀酸：工程化转运蛋白与还原型三羧酸酸途径的协同作用

《Bioresource Technology》：Bioconversion of the C1 substrate methanol to succinic acid with engineered Komagataella phaffii

面对化石资源依赖与粮食安全挑战，研究人员以甲醇这一C1平台化合物为底物，通过工程化改造毕赤酵母（Komagataella phaffii），引入黑曲霉（Aspergillus niger）与粟酒裂殖酵母（Schizosaccharomyces pombe）的二羧酸转运蛋白，并结合异源胞质还原型三羧酸（rTCA）途径，成功实现琥珀酸（SA）效价突破100 g·L?1。该研究确立了毕赤酵母作为C1生物制造平台的潜力，为构建可持续生物基化学品生产体系提供了新范式。

　　

在全球气候变化与碳中和目标的双重压力下，化工行业的“脱碳”转型已迫在眉睫。琥珀酸（Succinic Acid, SA），作为一种关键的C4平台化学品，不仅是生产生物可降解塑料聚丁二酸丁二醇酯（PBS）的核心单体，还广泛应用于食品、医药和表面活性剂领域。然而，目前的工业版图依然被石油化学路线主导——数据显示，2025年全球约11.5万吨的琥珀酸产量中，仍有60%源自化石燃料。这种对不可再生资源的依赖显然与可持续发展的理念背道而驰。

那么，能否找到一种既不与人争粮、又不与粮争地的替代原料呢？生物质虽然可行，但其预处理能耗高且受地域限制。此时，甲醇（MeOH）这一看似普通的C1化合物进入了科学家的视野。甲醇可以通过可再生能源驱动的二氧化碳催化加氢制备，理论上实现了碳循环利用。更重要的是，它能通过甲基营养型酵母——毕赤酵母（Komagataella phaffii）进行转化。毕赤酵母本是一种优秀的工业宿主，但在琥珀酸生产上存在天然短板：它缺乏高效的二羧酸转运系统。由于琥珀酸带有双负电荷，无法自由穿过细胞膜，若没有“运输大队长”——转运蛋白的协助，产物就会在细胞内堆积导致中毒，严重制约产量。

针对这一瓶颈，来自奥地利维也纳自然资源与生命科学大学（BOKU）的研究团队在《Bioresource Technology》上发表了一项突破性成果。他们巧妙地绕过了自然界的限制，通过合成生物学手段对毕赤酵母进行了系统性重编程，最终实现了从甲醇到琥珀酸的高效转化，效价惊人地超过了100 g·L^?1。

为了攻克这一难题，研究人员采用了多维度的技术策略。首先，利用CRISPR/Cas9基因编辑技术结合Golden Gate克隆技术，构建了精准的基因整合载体。其次，引入了异源二羧酸转运蛋白，分别来自黑曲霉（AnDCT-02）和粟酒裂殖酵母（SpMAE1），以解决产物外排障碍。同时，重构了胞质内的还原型三羧酸（rTCA）途径，引入了来自谷氨酸棒杆菌（Corynebacterium glutamicum）的苹果酸脱氢酶（CgMDH）、库德里阿兹威氏毕赤酵母（Pichia kudriavzevii）的延胡索酸酶（PkFUM1）以及布氏锥虫（Trypanosoma brucei）的延胡索酸还原酶（TbFRD1c）。最后，通过摇瓶初筛结合严格控制的补料分批发酵（Fed-batch）工艺，并利用高效液相色谱（HPLC）进行代谢产物定量分析，验证了工程菌株的性能。

3.1. Engineering transporters for SA export

在初步筛选中，研究团队首先评估了两种异源转运蛋白的功能。结果显示，无论是黑曲霉来源的AnDCT-02还是裂殖酵母来源的SpMAE1，都能显著提升琥珀酸的胞外分泌。其中，AnDCT-02的表现更为优异，在摇瓶培养中，其介导的琥珀酸产量是SpMAE1的4倍（使用组成型启动子P_GAP时）。有趣的是，启动子的选择对SpMAE1影响显著，使用甲醇诱导型启动子P_DAS1能使SpMAE1的产量提升2.5倍，而对AnDCT-02的影响则微乎其微。这表明AnDCT-02是更高效的转运体，且两者共表达并未产生叠加效应，暗示此时代谢流可能受到了下游酶促反应的限速。

3.2. Scalability of transporter strains in bioreactor cultivations

将实验放大到生物反应器后，情况出现了变化。在严格控制pH（5.5）和溶氧（30%）的条件下，尽管转运蛋白依然发挥了作用，但产物谱发生了偏移。此时，苹果酸（Malic Acid, MA）取代琥珀酸成为主要的分泌产物。表达AnDCT-02的菌株产生了高达44.2 g·L^?1的苹果酸和8.8 g·L^?1的琥珀酸，而共表达两种转运蛋白的菌株虽然苹果酸产量飙升至60.9 g·L^?1，琥珀酸却仅维持在12.1 g·L^?1。这说明转运蛋白对苹果酸具有更高的偏好性，如果不对胞内代谢流进行重定向，单纯依靠转运蛋白无法实现高纯度琥珀酸的生产。

3.3. Shifting the metabolic flux towards SA by overexpression of heterologous rTCA cycle genes

为了解决产物分布不均的问题，研究团队开始重构细胞内的代谢通路。他们尝试单独过表达苹果酸脱氢酶（CgMDH），结果导致苹果酸积累进一步加剧，证实了该酶能有效将草酰乙酸转化为苹果酸。随后引入延胡索酸酶（PkFUM1）后，原本低水平的延胡索酸（Fumaric Acid, FA）显著上升。最终的“决胜一步”是引入了布氏锥虫来源的延胡索酸还原酶（TbFRD1c）。这一酶促反应是不可逆的，能够强力地将延胡索酸还原为琥珀酸。实验结果表明，当三个酶（MDH、FUM、FRD）与转运蛋白协同表达时，琥珀酸产量实现了质的飞跃，分别达到106.9 g·L^?1（AnDCT背景）和100.5 g·L^?1（SpMAE背景），同时副产物苹果酸降至约5.5 g·L^?1，实现了代谢流的高效重定向。

3.4. Identification of essential genes for high succinic acid export via a top-down approach

为了精简基因线路并明确核心元件，研究人员采用了“自上而下”的策略，逐步敲除基因进行验证。结果发现，如果缺失了转运蛋白AnDCT-02，即便胞内拥有完整的rTCA途径，胞外的琥珀酸浓度也几乎为零（<0.3 g·L^?1），这无可辩驳地证明了转运蛋白是分泌的绝对前提。此外，单独表达延胡索酸酶（FUM）会导致苹果酸和延胡索酸积累，而单独表达延胡索酸还原酶（FRD）则能将琥珀酸提升至42.6 g·L^?1。最令人惊讶的是，删除了苹果酸脱氢酶（MDH）的菌株（AnDCT_FUM_FRD）依然能维持超过100 g·L^?1的琥珀酸产量。这意味着在该系统中，MDH对琥珀酸合成的贡献极小，甚至可能是多余的，而转运蛋白、延胡索酸酶和延胡索酸还原酶的“铁三角”组合才是高产的最小必需模块。

综合讨论部分的观点，这项研究清晰地揭示了毕赤酵母生产琥珀酸的两大关键壁垒：首先是跨膜运输，由于缺乏内源性转运蛋白，必须通过异源表达SLAC1家族的转运蛋白来打破分泌瓶颈；其次是代谢流的平衡，由于转运蛋白对苹果酸的高亲和力导致了副产物分流，必须引入强驱动力量的TbFRD1c来拉动反应向琥珀酸方向进行。

值得注意的是，该研究实现的100 g·L^?1以上的琥珀酸效价和0.5 g·g^?1以上的得率，已经足以比肩传统的葡萄糖基细菌发酵平台。虽然目前的体积生产率（0.5–0.6 g·L^?1·h^?1）距离工业顶尖水平还有差距，但这项工作首次有力证明了甲醇基毕赤酵母平台的巨大潜力。它不仅解决了底物竞争问题，还为利用温室气体（CO₂）衍生的甲醇生产高附加值化学品提供了切实可行的技术路线，是推动生物经济向低碳、可持续方向发展的一个重要里程碑。