一种人工无细胞途径，用于高效转化甘油-HCO3?为L-天冬氨酸，同时考虑ATP和辅因子的消耗平衡

《Bioresource Technology》：Artificial cell-free pathway for carbon-efficient glycerol-HCO3? conversion to l-aspartate with ATP and cofactor trade-offs

碳中性生物制造中，通过非细胞合成生物学方法将甘油与碳酸氢盐转化为L-天冬氨酸，模块化整合甘油氧化、丙酮酸羧化及还原胺化，工程优化醛脱氢酶活性5.4倍，解决关键动力学瓶颈，同时通过反应工程减少ATP非生产性消耗，最终实现75.4 mM L-Asp产率（摩尔转化效率75%），但高辅因子消耗制约经济性。

　　

作者：龙伟 Lou、子航 Xi、宗琳 Li、志民 Li

中国华东科技大学生物反应器工程国家重点实验室，中国上海梅龙路130号，200237

摘要

将废物中的碳高效转化为有价值的化学品，并同时利用HCO₃^?，是可持续生物制造领域的一个吸引人的目标。本文开发了一种无细胞酶级联系统，称为“人工甘油-HCO₃^?利用途径”，能够直接将甘油和HCO₃^?转化为L-天冬氨酸。该模块化途径结合了甘油氧化、丙酮酸羧化以及还原胺化反应，实现了将三碳底物高效转化为四碳氨基酸的过程。研究发现醛脱氢酶是该反应的主要动力学瓶颈，通过结构导向工程改造后，其活性提高了5.4倍，显著增强了丙酮酸的生成量。在碳固定模块中，发现了丙酮酸羧化酶导致的非生产性ATP和NADH水解现象，并通过反应工程得到了改善，从而提高了辅因子的利用效率。在优化条件下，该系统能够以75%的摩尔转化率从甘油中生成75.4 mM的L-天冬氨酸。进一步扩展该途径，还可以生成L-高丝氨酸和R-乙酰丙酮，进一步展示了该平台的模块化和氧化还原操作潜力。然而，当前系统的高效率是以大量的ATP和辅因子消耗为代价的，这在当前经济条件下限制了其市场竞争力。这些结果证明了该途径在高效转化甘油-HCO₃^?为L-天冬氨酸方面的可行性，同时也指出了未来研究中需要改进ATP和辅因子利用效率的关键问题。

引言

将废物中的碳转化为高附加值化学品的可持续制造路线是低碳生物经济的重要目标（Inrirai等人，2024年；Liu等人，2020a年；Liu等人，2020b年；Luo等人，2023年）。在这方面，将废物转化与二氧化碳（CO₂）固定相结合的策略尤其具有吸引力，因为它们同时解决了资源利用和碳管理的问题（Inrirai等人，2024年；Luo等人，2022年）。甘油作为生物柴油生产过程中的副产品，产量庞大且碳含量较低（Kumawat等人，2024年）。尽管甘油已被广泛研究用于燃料和大宗化学品的转化，但将其与CO₂固定相结合的研究仍然较少（Gao等人，2015年；Liu等人，2020a年；Liu等人，2020b年；Lou等人，2024年）。

自然代谢的限制是一个主要障碍。在生物系统中，甘油向L-天冬氨酸（L-Asp）等氨基酸的转化受到严格调控，主要是为了支持细胞生长而非产物积累（Hole?ek，2023年；Wang等人，2024年）。通过脱羧反应导致的碳损失较为常见，这降低了原子经济性，限制了净CO₂固定的潜力。虽然天然的CO₂固定途径（如卡尔文循环）已被充分研究，但其较低的催化速率和高能量需求限制了其在合成生产中的应用（Puiggené等人，2025年）。这些限制凸显了开发能够绕过代谢调控并最小化碳损失的人工酶途径的必要性。

体外

合成酶学为解决这些挑战提供了合适的框架（Cai等人，2021年；Luo等人，2022年；Rice等人，2025年）。通过在细胞外组装定义好的酶级联反应，可以精确控制反应物流量、辅因子平衡和操作条件（Kumar和Park，2018年；Rice等人，2025年）。这种方法使得设计出直接将碳转化与CO₂固定相结合的非天然途径成为可能。然而，这类系统常常存在酶之间的动力学不兼容性和辅因子利用效率低的问题，从而严重限制了整个途径的性能和稳定性（Puiggené等人，2025年）。

本文报道了“人工甘油-HCO₃^?利用（AGCU）”途径的设计与实现，该途径能够直接将甘油和无机C1来源转化为L-天冬氨酸。在该途径中，甘油作为三碳骨架，通过从HCO₃^?中固定一个额外的碳原子而得到四碳氨基酸，且过程中没有净碳损失。该途径被组织成模块化单元，便于进行系统优化。通过改造限速酶醛脱氢酶（Di Costanzo等人，2007年），其活性提高了5.4倍；同时发现了碳固定模块中的非生产性辅因子水解现象并得到了抑制（Valle，2017年）。在优化条件下，该系统从甘油中生成了75%的L-天冬氨酸。此外，模块化架构还允许该途径扩展到L-高丝氨酸（L-Hse）和R-乙酰丙酮，证明了该平台在结合甘油转化与HCO₃^?利用方面的多功能性。

菌株、质粒、化学品和培养基

使用Escherichia coli TOP10（Sangon Biotech）进行质粒扩增和保存。使用E. coli BL21（DE3）（Novagen）和质粒pET28a（+）（Novagen）进行蛋白质表达。所有化学品均购自Macklin（中国上海）。本研究中使用的多磷酸盐为六偏磷酸钠。Luria-Bertani（LB）或Terrific Broth（TB）培养基中添加了50 μg·mL^?1的卡那霉素，用于E. coli细胞培养和重组蛋白表达。

重组酶的表达与纯化

人工甘油-HCO₃^?利用途径的设计与体外重组

“人工甘油-HCO₃^?利用（AGCU）途径旨在通过模块化酶架构将甘油和HCO₃^?转化为PYR、L-天冬氨酸（L-Asp）、L-高丝氨酸（L-Hse）和R-乙酰丙酮（R-acetoin）（图1）。该途径整合了DHA途径（Kumar和Park，2018年）、丙酮酸羧化酶（PYC）介导的碳固定（Rice等人，2025年）、MGO的合成与解毒（Akinrimisi等人，2025年），以及通往L-Hse和R-乙酰丙酮的下游生物合成途径（Bae等人，2021年；Wang等人，2024年）。

结论

将废物中的碳高效转化为高价值化学品对于可持续生物制造至关重要。本研究开发了一种人工甘油-HCO₃^?利用途径，这是一种体外酶系统，集成了甘油转化、HCO₃^?利用和辅因子再生功能，用于生产L-天冬氨酸（详见补充材料）。该模块化设计规避了细胞代谢的限制，展示了无细胞合成酶学的价值。

CRediT作者贡献声明

龙伟 Lou：撰写初稿、方法学设计、实验研究、数据管理。 子航 Xi：软件开发、实验研究、数据管理。 宗琳 Li：撰写与编辑、实验研究、数据管理。 志民 Li：撰写与编辑、资源协调、资金获取、数据分析、概念构思。

资助

本研究得到了中国国家重点研发计划（2022YFC3401700）和中国国家自然科学基金（32501126）的支持。

利益冲突声明

作者声明没有已知的财务利益冲突或个人关系可能影响本文的研究结果。

致谢

我们感谢TIB的Yi-Heng P. Job Zhang教授在成本分析方面提供的指导。