对载有半胱胺的纳米脂质体在水牛精子冷冻保存中的多方面评估：其对精子运动能力、超微结构完整性、氧化平衡、凋亡基因表达及生育能力的影响

《Cryobiology》：Multifaceted evaluation of cysteamine-loaded nanoliposomes in buffalo sperm cryopreservation: Impacts on motility, ultrastructural integrity, oxidative balance, apoptotic gene expression, and fertility

本研究评估了将半胱氨酸负载纳米脂质体（CY-NPs）加入牛冷冻精子扩展剂对精子质量、运动学、氧化还原状态、凋亡变化、超微结构和生育力的影响。实验显示，添加50 μg/mL CY-NPs可显著提升精子活力、抗氧化酶活性（如SOD、CAT、GPx），降低脂质过氧化产物MDA水平，减少凋亡率，保护精子膜结构和线粒体完整性，使母牛妊娠率提高23.33%（p=0.0001）。

　　

摘要

本研究旨在评估将负载半胱胺的纳米脂质体（CY-NPs）添加到精液延长剂中对精液质量、精子运动学、氧化还原状态、类似凋亡的变化、超微结构以及生育能力的影响。从七头健康、具有生育能力的公牛（4-6岁）中通过人工阴道技术收集精液，在六周内共获得42份射精样本。每个样本进行了三次重复分析。将收集到的精液混合后，使用含有0、25、50或100 μg/mL CY-NPs的Tris基延长剂进行冷冻保存。多项式回归分析显示，当CY-NPs浓度为60-75 μg/mL时，精子的前向运动能力、膜功能性和存活率达到峰值。CY-NPs的添加改善了精子的运动学特性，提高了总抗氧化能力，并增强了关键抗氧化酶（包括过氧化氢酶、超氧化物歧化酶和谷胱甘肽过氧化物酶）的活性，同时显著降低了精浆中的丙二醛、核因子κB和一氧化氮水平（p < 0.05）。凋亡精子的比例显著下降，同时抗凋亡基因Bcl-2上调，促凋亡基因Bax和caspase 3下调。电子显微镜观察证实CY-NPs保护了精子的超微结构，包括质膜、顶体和线粒体。值得注意的是，添加50 μg/mL CY-NPs的精液在解冻后的生育能力提高了23.33%（p = 0.0001）。总体而言，将CY-NPs添加到冷冻延长剂中提高了精液的质量、速度、抗氧化状态和酶平衡，减少了凋亡，保持了结构完整性，并改善了冷冻保存的水牛精子的生育能力。

引言

水牛是肉和牛奶的重要来源；然而，它们的繁殖性能受到诸如无声发情、产犊间隔长和生育能力低等关键问题的限制[12]。随着传统繁殖方法难以满足日益增长的需求，人们越来越重视先进的繁殖技术以提高繁殖效率和加速遗传改良[8]。冷冻保存以及辅助繁殖技术（如体外受精、胞浆内注射和人工授精）被广泛用于克服动物和人类的不孕问题[31]。在这些方法中，人工授精特别有助于提高水牛的繁殖性能。冷冻保存可以长期储存精子，但由于冰晶形成、热冲击、氧化应激和膜结构的变化，可能会导致细胞损伤[4]。氧化应激主要由自由基引起，通过破坏活性氧（ROS）与机体抗氧化防御系统之间的平衡来损害精液质量[15,32]。由于水牛的细胞质和抗氧化防御能力有限，且其膜富含不饱和脂肪酸，因此精子细胞特别容易受到损伤。这种脆弱性导致精子运动能力下降、形态改变和生育能力降低[22]。为了解决这些问题，研究人员研究了在精液延长剂中使用合成和天然抗氧化剂。通过中和ROS和防止脂质过氧化，这些抗氧化剂可以改善解冻后的精子质量，包括运动能力、存活率和膜功能[8,20]。因此，抗氧化剂的补充已成为在冷冻保存过程中维持精子功能的一种实用方法。

半胱胺（β-巯基乙胺）是一种天然存在的低分子量硫醇，可以调节动物的代谢和内分泌功能[26]。它通过刺激谷胱甘肽（GSH）的合成来增强机体对ROS的防御能力，主要是通过促进半胱氨酸的吸收[18]。半胱胺与半胱氨酸结合形成混合二硫化物，这些二硫化物被细胞吸收后还原为自由硫醇，从而促进GSH的合成[26]。GSH作为一种重要的抗氧化剂，可以直接清除ROS并增强关键抗氧化酶的活性[24]。研究表明，在冷冻保存前将半胱胺添加到精液延长剂中可以提高解冻后精液的质量，并改善水牛和牛在体外培养中的胚胎发育[13]。尽管半胱胺具有显著的生物学益处，但由于其半衰期仅为1.75小时、水溶性差以及容易迅速氧化为无活性的物质，导致药代动力学特性不佳[13]。因此，将这种分子封装在脂质体等递送系统中已成为一种广泛采用的策略，以克服这些挑战[23]。封装技术通过提供针对加工和储存过程中不利环境因素的保护屏障，有效延长了生物活性化合物的寿命[37]。此外，脂质体还可以提高抗氧化剂的热稳定性和pH稳定性以及水溶性[34]。无论是酶类抗氧化剂（如超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽过氧化物酶（GPx）和过氧化氢酶（CAT），还是非酶类抗氧化剂（如α-生育酚、γ-生育酚、N-乙酰半胱氨酸、CoQ-10、白藜芦醇和谷胱甘肽），在脂质体中封装后都能表现出更好的抗氧化组织损伤效果[10]。这种改善归因于封装剂在细胞内的持续释放和加速的细胞内递送[35]。在本研究中，我们制备了负载半胱胺的纳米脂质体（CY-NPs），并首次通过评估精液特性、运动学参数、精浆酶活性、氧化还原状态、与凋亡相关的变化、超微结构完整性和妊娠率来评估其对解冻后水牛精子质量的益处。

章节片段

CY-NPs的制备和表征

根据Shalaby等人的方法（31），使用薄层水化法制备CY-NPs。将一定量的大豆卵磷脂（50 mg）与半胱胺混合，最终浓度分别为25、50和100 μg，然后将混合物溶解在8 mL乙醇中。所得溶液转移到圆底烧瓶中，并使用旋转蒸发器（Heidolph，德国）在40°C下真空蒸发乙醇。干燥后的脂质膜用10 mL磷酸盐缓冲液进行水化

CY-NPs的表征

图1A显示了CY-NPs的TEM图像，显示出最小的聚集和几乎均匀的球形。如图1B所示，TEM分析显示颗粒大小在20到55 nm之间。DLS分析进一步确认颗粒大小为96.15 nm，PDI为0.498（图1C）。Zeta电位分析也证实了表面电荷为-23 mV（图1D）。

CY-NPs对精子特性和速度参数的影响

如表2所示，向公牛精液冷冻延长剂中添加不同浓度的CY-NPs

讨论

冷冻保存和人工授精可以改善动物的繁殖能力，但由于存活率和运动能力下降、冰晶造成的膜损伤、冷冻保护剂的影响、冷冲击、渗透压应激和ROS诱导的脂质过氧化，许多精子在冷冻过程中会失去生育能力[23]。冻融循环会导致氧化应激，损害新陈代谢并促进凋亡，破坏DNA、膜和蛋白质，降低顶体和质膜的完整性、精液质量和生育能力[8,36]。

结论

将CY-NPs添加到水牛精液的冷冻延长剂中显著提高了解冻后的运动能力、抗氧化能力和超微结构完整性。这些益处主要归因于精子活力的提高和形态的正常化，以及质膜和顶体完整性的保持，同时防止了ALT、AST和ALP等酶的泄漏，这些酶对能量代谢至关重要，并增强了精子对冷冻损伤的抵抗力。此外，

CRediT作者贡献声明

Ekramy M. Elmorsy：撰写 – 审稿与编辑、研究、资金获取、概念化。Amer K. Mohammed：撰写 – 原始草稿、方法学、概念化。Badriah A. Hifni：撰写 – 审稿与编辑、撰写 – 原始草稿、方法学、研究。Shaza A. Alyamani：撰写 – 审稿与编辑、撰写 – 原始草稿、研究、概念化。Ayat B. Al-Ghafari：撰写 – 审稿与编辑、方法学、研究、正式分析。Huda A. Al Doghaither：

伦理声明

所有涉及动物的实验均遵循《国际生物医学研究涉及动物指导原则》，并符合欧洲议会和理事会2010年9月22日关于用于科学目的的动物保护的指令2010/63/EU。根据该指令，实验方案经过了INIA动物研究伦理委员会的审查和批准（批准报告CEEA2014/087）。

生成式AI和AI辅助技术的声明

作者声明，仅使用基于人工智能（AI）的工具（ChatGPT、OpenAI，美国）来帮助改进手稿文本的清晰度、语法和流畅性。

资助

作者感谢沙特阿拉伯北方边境大学通过项目编号（NBU-CRP-2026-2510）对本工作的支持。

利益冲突

作者声明与手稿中讨论的任何组织没有利益冲突。

致谢

作者感谢所有为这项研究提供技术支持、行政协助和一般指导的人士，但他们不符合作者资格的标准。