锌指基因SQSTM1/p62参与了剃刀蛤（Sinonovacula constricta）对氨氮胁迫的响应过程

《Developmental & Comparative Immunology》：The zinc finger gene SQSTM1/p62 is involved in the response to ammonia nitrogen stress in the razor clam (Sinonovacula constricta)

锌指蛋白p62在氨氮胁迫下调控自噬和细胞凋亡机制研究。刀鱼Sc-p62在短期和长期胁迫下均差异表达，具有正选择特征，其肝胰脏高表达且显著上调。RNA干扰Sc-p62可抑制自噬相关基因（NBR1、GABARAP、LC3）表达，减轻组织损伤和细胞凋亡，提示Sc-p62通过自噬途径参与氨氮适应。

　　

李书琪|姚涵涵|吕丽媛|林志华|魏子正|董英辉|孙长森

中国浙江省万里大学高等农业科学学院，宁波

摘要

锌指蛋白SQSTM1（通常称为p62）是自噬和细胞应激反应的重要调节因子。 razor clam（Sinonovacula constricta）在集约化水产养殖条件下经常暴露于氨氮胁迫中，这使其成为研究氨适应性的理想模型。然而，p62在razor clam中的系统发育关系和功能仍知之甚少。转录组分析显示，在短期和长期氨暴露下，Sc-p62的表达存在差异，并被鉴定为正向选择的基因。Sc-p62在肝胰腺中高表达，并在氨胁迫下显著上调。通过RNA干扰Sc-p62可降低与自噬相关的基因（包括NBR1、GABARAP和LC3）的表达，从而减轻氨胁迫引起的肝胰腺组织损伤和细胞凋亡。总体而言，我们的发现表明Sc-p62可能参与调节S. constricta对氨氮胁迫的自噬途径。这些结果为了解p62在双壳类软体动物中的功能提供了新的见解。

引言

氨与其他许多毒物不同，因为它既可由动物产生，又对动物有毒。在水生环境中，氮以两种形式存在：NH₄⁺和NH₃。在特定条件下，氨氮处于解离平衡状态，NH₄⁺和NH₃可以在水中相互转化，总氨量是[NH₃] + [NH₄⁺]的和（Ip等人，2001年）。同时，在集约化和高密度的水产养殖系统中，含有氮的有机物（如剩余饲料、粪便和尸体）会导致养殖水中氨氮的过度积累，严重影响底栖生物的生长、免疫和存活。研究表明，长期暴露于高浓度的氨氮会导致水生动物出现多种生理毒性反应，包括氨代谢紊乱、氧化应激失衡、免疫抑制和组织损伤（Sun等人，2024年；Weihrauch等人，2009年）。

先前的研究表明，氨氮胁迫可以诱导水生物种产生多种生理和分子反应。例如，在集约化条件下养殖的太平洋白虾Litopenaeus vannamei中，氨和亚硝酸盐的联合暴露会导致肝胰腺和鳃部的更严重组织病理损伤。此外，甲壳类和双壳类动物在氨氮胁迫下表现出复杂的分子反应机制，涉及免疫调节、能量代谢和细胞应激（Li等人，2021年；Liang等人，2016年）。对L. vannamei和太平洋牡蛎Crassostrea gigas的研究表明，在高氨氮条件下，与自噬和凋亡相关的基因显著上调，表明细胞清除和程序性死亡机制被共同激活（Meng等人，2025年；Wang等人，2021年）。在马尼拉蛤Ruditapes philippinarum中，氨氮暴露实验显示摄食和呼吸行为受到显著抑制（Cong等人，2021年），溶酶体的完整性受到破坏，表明免疫功能可能受到抑制（Cong等人，2017年）。在黄鲶Pelteobagrus fulvidraco中，慢性氨胁迫显著降低了胃蛋白酶、胰蛋白酶和糜蛋白酶的活性，导致肠道菌群失调、结构损伤和正常肠道生理功能受损（Luo等人，2024年）。总体而言，这些研究表明氨氮胁迫可以引起水生生物的多种生理和细胞紊乱，包括代谢失衡、免疫功能障碍和细胞损伤。

生物体具有复杂的机制来维持细胞稳态并应对各种环境压力，包括温度波动、盐度变化、缺氧和氨氮胁迫（Camacho-Jiménez等人，2023年；Hao等人，2025年；Mei等人，2025年；Ngxabi等人，2025年；Sun等人，2020年）。在这些机制中，自噬在去除受损蛋白质和细胞器以及在环境压力下维持细胞稳态方面起着关键作用。锌指蛋白是生物体中的一个大家族，参与多种生物过程，如凋亡、自噬和干细胞维持，并在应激反应中发挥重要作用。氨氮的积累会扰乱水生动物的氨代谢，在慢性毒性下导致高氨血症，并干扰自噬通量和蛋白酶体功能（Gao等人，2024年；Tong等人，2024年；Zhang等人，2019年）。在这种情况下，自噬受体蛋白p62（也称为sequestosome-1，SQSTM1），作为锌指蛋白家族的成员，在通过自噬途径识别泛素化蛋白聚集体并介导其降解方面起着核心作用（Pankiv等人，2007年；Seibenhener等人，2004年）。p62不仅对氧化应激有反应，还参与对重金属、有机污染物和藻类毒素等各种环境压力的细胞反应（Lee等人，2017年；Sun等人，2024年；Wu等人，2023年）。尽管p62的调控机制在脊椎动物中已得到广泛研究，但在氨氮胁迫下的分子特性和调控作用，特别是在水生无脊椎动物中，仍知之甚少。

p62蛋白是一种多功能蛋白，主要定位于细胞质中，能够在细胞质和细胞核之间穿梭。它包含多个功能域，包括UBA、PB1、LIR、锌指域和Keap1结合区。其中，UBA域结合泛素化底物，LIR区域与LC3蛋白相互作用，PB1域通过自组装或激酶结合介导同二聚化或异二聚化（Lamark等人，2017年）。功能上，p62作为选择性自噬的关键受体，其中ZZ和PB1域调节LIR序列的暴露，从而将底物靶向自噬体进行降解（Alcober-Boquet等人，2024年）。除了在自噬中的作用外，p62还参与多种与应激适应相关的细胞信号通路。在阿尔茨海默病患者的大脑中观察到p62表达水平升高，表明其在神经退行性应激反应中的重要作用（Kuusisto等人，2001年）。在小鼠心脏中，p62通过稳定Hif-1α和Nrf2来缓解缺氧引起的心脏功能障碍，突出其在缺氧应力下的保护作用（Ghosh等人，2024年）。在缺氧微环境中（例如淋巴器官），p62有助于维持Erk1/2（MAPK）的磷酸化以及缺氧树突状细胞（DCs）的存活，可能延长DC的寿命（Coppola等人，2024年）。尽管p62在自噬和信号转导中的功能在脊椎动物中已被充分研究，但在无脊椎动物中的研究相对有限，主要集中在模式生物上。然而，在软体动物中，关于p62的研究仍然很少，仅在L. vannamei和淡水贻贝Cristaria plicata等物种中有少量报道（Luo等人，2025年；Wu等人，2023年）。然而，其在环境应力下的表达调控和生理功能在软体动物中仍不清楚。

Sinonovacula constricta（俗称razor clam）是中国沿海泥滩上广泛养殖的四大主要经济双壳类物种之一（Wu等人，2018年），也是浙江省的主要水产养殖物种。它通常生活在高密度池塘养殖环境中（200-300个个体/平方米），其中剩余饲料和排泄物的积累经常导致沉积物中的氨氮水平升高，从而引起蛤蜊的慢性氨暴露和相应的毒性应激（Sun等人，2024年）。潮间带软体动物在波动的环境因素下进化，通常表现出对多种压力的强适应性（Song等人，2024年）。这种适应性涉及一系列生态毒性反应，包括炎症、组织损伤、细胞能量水平下降以及各种组织的生理和代谢功能紊乱（Jia等人，2017年；Li等人，2016年；Zhang等人，2021年）。在razor clam中，先前的研究表明Sc-GDH在体内对外源氨的响应中起着关键作用，而Sc-SMCT1_2可能在氨暴露急性期后参与乳酸和NH₄⁺的转运（Meng等人，2025年；Sun等人，2021年）。然而，锌指蛋白，特别是p62在S. constricta中的潜在作用尚未报道。在本研究中，我们首先调查了S. constricta在氨氮胁迫下的p62（Sc-p62）表达水平，并进行了正向选择分析。接下来，我们表征了Sc-p62的基因结构和系统发育关系，并检查了Sc-p62在氨氮胁迫下的表达模式。此外，还进行了Sc-p62的siRNA干扰，以评估肝胰腺的形态损伤，并阐明Sc-p62在氨氮胁迫下调节细胞凋亡的作用。我们的研究将为Sc-p62在氨氮适应中的分子机制提供有价值的见解，并有助于提高S. constricta的氨耐受性的选择性育种。

实验部分

动物准备和样本收集

从中国宁波市宁海县的水产养殖场收集了健康的成年razor clam（一岁，平均湿重11.08±2.10克，平均壳长55.23±2.10毫米）。在正式实验之前，所有razor clam都在受控盐度（21±1）和温度（20.0±1.0°C）下进行了严格的4天适应。盐度和温度由AZ8371盐度计（Hengxing，台湾，中国）和AQT-15晶体温度计（Voonline）监测。

转录组差异分析和正向适应性进化

基于我们之前对S. constricta在氨氮胁迫下的基因组和转录组分析，鉴定了84个差异表达的锌指蛋白基因（ZFP），这些基因表达趋势具有高度的时间依赖性。急性氨氮暴露1天后，82个DEGs发生了广泛的变化，自噬基因Sc-p62上调最为显著。经过长期暴露（10天）后，只有16个DEGs表现出差异变化，其中Sc-p62

讨论

当氨在生物体内积累到一定水平时，会引起一系列损伤，如生长抑制、氧化应激诱导和细胞凋亡（Lin等人，2024年；Zhang等人，2024年；Zou等人，2023年）。生活在高密度水产养殖系统中的动物尤其受到影响，尤其是像S. constricta这样的底栖双壳类动物，它们栖息在30–40厘米深的泥滩中（Sun等人，2024年）。为了应对恶劣的环境，生物体可以调节其生理反应

结论

在这项研究中，我们首先确定了Sc-p62是氨氮胁迫转录组中差异表达的基因。更重要的是，在Sc-p62中鉴定出十个正向选择位点。Sc-p62含有保守的锌指结构域，并与相关双壳类物种具有高度同源性。Sc-p62在肝胰腺中的表达高于其他组织，并在氨胁迫下显著上调。此外，敲低Sc-p62会降低表达

CRediT作者贡献声明

姚涵涵：写作 – 审稿与编辑，数据管理。吕丽媛：数据管理。林志华：概念构思。魏子正：研究。李书琪：写作 – 初稿，可视化，研究，数据管理。孙长森：写作 – 审稿与编辑，方法学。董英辉：写作 – 审稿与编辑，方法学，概念构思

未引用参考文献

Aruga和Hatayama，2018年；Lin等人，2024年；Meng等人，2025年；Sun等人，2024年；Sun等人，2024年；Tan等人，2017年；Zhao等人，2018年。

利益冲突声明

作者声明没有非财务或财务利益冲突。

致谢

本工作得到了国家自然科学基金（U23A20247和32202918）、浙江省重大科技计划（2021C02069-7）、温岭市关键研发项目（2023N00003）和国家海洋遗传资源中心计划的支持。