《Enzyme and Microbial Technology》：Structural diversity and functional versatility of bacterial lactate dehydrogenases: Guideline for designing robust industrial enzyme
编辑推荐：
细菌乳酸脱氢酶（LDHs）的结构多样性、催化机制及其在工业生物催化中的应用被系统综述。重点探讨了D-LDH和L-LDH的分子决定因素，细菌LDHs的高产表达与稳定性优化策略，以及酶固定化技术对功能提升的影响。研究揭示了细菌LDHs在生物传感器、诊断试剂和可穿戴生物燃料电池等新兴领域的潜力，并提出了通过基因工程和定向进化改善酶性能的途径。
阿德·格里亚尼·古斯蒂（Ade Griani Gusti）、阿尼迪塔·奥利亚·佩尔蒂维（Anindita Aulya Pertiwi）、拉迪蒂奥·潘格斯特（Radityo Pangestu）
印度尼西亚茂物市国家研究与创新机构（BRIN）基因工程研究中心
摘要
乳酸脱氢酶（LDHs）是现代生物化学中最经典、研究最深入的酶之一，具有广泛的功能和技术应用价值。它们作为诊断试剂盒、生物传感器、生物电子学和生物催化系统中的核心组成部分。尤其是细菌来源的LDHs，因其复杂的调控机制和出色的稳定性而备受关注，这使得它们非常适合工业应用，同时也需要对其进行合理的重新设计。本文综述了来自不同细菌物种的D-LDHs和L-LDHs的结构特征和催化机制，重点探讨了决定其独特酶活性的分子因素。文章讨论了参与催化、别构调控和辅因子结合的关键氨基酸残基的功能，以及基因工程和固定化策略的最新进展，这些进展提高了酶的产量和稳定性。总体而言，这些研究为设计具有特定应用特性的LDH变体提供了理论基础。最后，本文还探讨了细菌LDHs在环境科学、医学和材料科学等生物技术领域的潜在应用前景。
引言
乳酸脱氢酶（LDHs）作为细胞氧化还原平衡的核心调节因子，在现代绿色产业中发挥着至关重要的作用。基于这一重要性，LDHs已被广泛应用于多种领域，从立体选择性生物催化和生物传感到可持续生物塑料生产的代谢工程[1]，[2]，使其成为最通用的酶之一。由于在代谢中的核心作用，LDHs几乎存在于所有生命形式中。然而，与真核生物中的LDHs相比，细菌来源的LDHs在结构和调控方面表现出更大的多样性[3]。此外，细菌系统中的酶生产速度更快，更易于进行基因优化，并且更适合大规模生产[4]，[5]。这些特性使得细菌LDHs非常适合各种专门的工业应用。
LDHs催化甘油醛酸（2-oxopropionoate）的立体选择性还原（即丙酮酸）生成2-羟基丙酸（即乳酸）。这种高度立体选择性的还原反应可产生两种对映体：L-LDH（EC 1.1.1.27）和D-LDH（EC 1.1.1.28），分别生成L-乳酸（S，+）和D-乳酸（R，–）[6]。虽然大多数真核生物主要产生L-乳酸，但某些细菌物种能够同时产生两种形式的LDH[3]，[6]。一些细菌还拥有多个编码L-LDH和D-LDH的基因，这些基因具有不同的调控机制和辅因子偏好[7]，[8]，[9]，[10]，[11]，从而能够在多种条件下表达这两种酶，扩大了它们的应用范围。环境压力和频繁的水平基因转移可能促进了细菌LDHs的高突变率[3]，[6]，推动了其在工业应用条件下的基因调控机制和酶稳定性的进化。
此外，LDHs属于一个庞大的古老超家族——2-羟基酸脱氢酶（2-HADHs），该家族还包括羟基异己酸脱氢酶（HicDHs）和苹果酸脱氢酶（MDHs），后者与LDHs关系最为密切[12]，[13]。尽管LDHs和MDHs都催化2-氧代酸还原为相应的2-羟基酸产物，并使用相同的氧化还原辅因子烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH），但它们在底物选择性上存在差异：MDHs主要作用于2-氧代丁二酸（即草酰乙酸），而LDHs则偏好丙酮酸。这种差异主要由102位点的保守残基决定：MDHs中的精氨酸和LDHs中的谷氨酰胺[13]，[14]，尽管某些细菌LDHs对草酰乙酸也有一定活性[15]。此外，一些细菌中的“类LDH”L-MDHs具有类似于大多数L-LDHs的四聚体四级结构（通常是四聚体），这与L-MDHs的主要二聚体结构形成对比，并在系统发育上介于LDHs和MDHs之间[13]。然而，目前尚无证据表明这些L-MDHs对丙酮酸具有活性。这些比较表明，通过工程改造底物选择性有可能拓宽酶的功能范围。
本文综述了细菌LDHs作为多功能生物催化剂的研发进展，重点探讨了其基于结构和机制特性的活性和性质。同时，鉴于其工业应用价值，本文还介绍了在异源系统中生产这些酶并提高其操作性能的多种策略。通过整合这些信息，本文为未来设计针对特定应用的改进型酶提供了指导。
工业中细菌乳酸脱氢酶的作用
细菌LDHs是厌氧代谢中的关键催化成分，在将甘油醛酸（糖酵解的最终产物）转化为乳酸的过程中起着重要作用。因此，它们的主要工业应用是在全细胞生物催化系统中促进乳酸的生产，尤其是使用如Lactococcus、Lactobacillus和Enterococcus等乳酸菌
细菌乳酸脱氢酶催化机制的多样性
不同来源的LDHs在催化机制、产物或底物立体选择性、辅因子和激活剂方面的差异，决定了其应用的多样性。深入理解细菌LDHs的作用机制和多样性对于开发更高效、更有效的工业应用至关重要。早期研究报道了Streptococcus LDH与动物LDH在别构调控上的差异[41]多种工业条件下的结构稳定性
生物技术的进步使得细菌LDHs在环境科学、食品工程、化妆品和制药等多个行业中得到广泛应用。然而，由于这些酶本身的稳定性有限，它们往往需要在特定条件下（如低pH值、高温或存在抑制性金属离子）进行优化。因此，全面了解细菌LDHs的稳定性特征非常重要异源表达
无论是作为纯化酶还是在全细胞系统中使用，只有当LDHs具有高催化活性并能大量生产时，才能有效应用于商业领域。虽然许多野生型细菌能自然产生大量LDH，但异源表达系统可以实现更高且更可控的酶生产。E. coli作为表达宿主，结合各种载体和重组菌株，长期以来一直是生产LDH的首选酶的固定化
固定化不仅提高了酶的活性，还增强了其可回收性。然而，必须选择合适的固定化方法，以避免干扰底物与催化位点的相互作用，因为这会削弱酶的催化效果。固定化技术具有不同的优缺点，如表5所示。例如，Salinispirillum中His标签标记的D-LDH的活性结论与未来方向
将细菌LDHs视为迄今为止发现的最通用和最具工业价值的酶之一并不夸张。它们的功能范围已远远超出传统的乳酸发酵作用，使其成为生物传感器、诊断试剂盒、不对称催化剂甚至可穿戴生物燃料电池中的核心生物分子。基因工程、蛋白质设计和酶固定化的进步在推动这些酶的应用方面发挥了重要作用利益冲突声明
作者声明没有与本文内容相关的利益冲突。致谢
本研究得到了印度尼西亚教育基金会（LPDP）和国家研究与创新机构（BRIN）的支持，具体通过RIIM生物分子结构生物学合作平台及2024年生命科学与环境研究组织计划的支持。
