THOC6缺乏会导致心肌病，原因是它减少了心肌细胞中的心肌收缩蛋白

《Experimental Cell Research》：THOC6 deficiency leads to Cardiomyopathy by Reducing Myocardial Contractile Proteins in Cardiomyocytes

THOC6基因敲除通过RNA测序和蛋白质相互作用分析揭示了其对心肌细胞增殖、凋亡及胶原蛋白表达的调控作用，为心脏发育机制研究提供新证据。

　　

袁伟华|江子怡|李凤霞|陈宏宇|张希成|范向明

浙江大学医学院儿童医院，国家儿童和青少年健康与疾病临床研究中心，杭州，310052，中国

摘要：

背景

THOC6蛋白是THO复合体的重要组成部分。THOC6基因的双等位基因功能丧失变异与Beaulieu–Boycott–Innes综合征（BBIS；OMIM 613680）相关。尽管研究主要集中在THOC6在神经发育障碍中的作用，但大约80%的BBIS患者表现出心脏异常，包括结构性心脏病、心肌病和心律失常。然而，THOC6表达与心脏发育之间的联系仍需进一步探索。本研究首次探讨了THOC6在心脏发育中的作用。

方法和结果

首先，我们使用CRISPR/Cas9技术在H9C2心肌细胞中敲除了THOC6基因，发现细胞增殖减少，凋亡增加。通过RNA测序（RNA-seq）分析，我们发现THOC6敲除后H9C2细胞中发生了大量基因变化，这些变化与肥厚型心肌病、致心律失常性右心室心肌病和扩张型心肌病相关。蛋白质-蛋白质相互作用分析和实验验证表明，THOC6调控心肌细胞中I型胶原蛋白（COL1A1、COL1A2）和细胞骨架蛋白（心肌α-肌动蛋白1）的表达。随后，我们利用CRISPR/Cas9技术在来自健康个体的诱导多能干细胞（hiPSCs）中生成了THOC6敲除细胞系。THOC6在hiPSCs衍生的心肌细胞（hiPSC-CMs）中的敲除导致肥厚型心肌病和扩张型心肌病的早期表现特征，包括肌节结构的破坏。值得注意的是，THOC6敲除的hiPSC-CMs中COL1A2和β-微管蛋白的表达水平显著降低。

结论

THOC6可能通过调控心肌收缩蛋白（主要是I型胶原蛋白、心肌α-肌动蛋白1和β-微管蛋白）来影响心脏发育。

引言

Beaulieu–Boycott–Innes综合征（BBIS；OMIM 613680）是一种罕见的常染色体隐性遗传病，其特征为智力障碍、面部畸形、发育迟缓、心脏和泌尿生殖系统结构异常以及龋齿。2013年，Beaulieu等人首次在4名BBIS患者中发现了THOC6基因的纯合变异[1]。此后，又描述了约22名携带致病性THOC6变异的病例[2]、[3]、[4]、[5]、[6]、[7]。

THOC6是THO复合体的关键组成部分，而THO复合体又是转录/输出（TREX）组装的核心部分。TREX在转录位点组装，与mRNA 5'帽结构及剪接后保留的外显子连接复合体相互作用，并优先结合经过适当处理的mRNA。然后通过ALYREF招募并激活输出受体NXF1–NXT1，将mRNA引导通过核孔[4]。THO复合体包含多个亚基，如THOC1、THOC2、THOC3、THOC5、THOC6和THOC7，每个亚基都具有不同的结构域，负责特定功能[8]、[9]、[10]、[11]。THOC6构成了TREX复合体的结构核心，确保只有经过适当处理的mRNA能够高效地输出到细胞质中。THOC6的缺失或其变异形式的表达会抑制四聚体的形成，同时保持TREX二聚体的完整性[12]。

研究表明THOC6与智力障碍之间存在关联[1]、[4]、[5]、[6]、[7]。

在BBIS患者中，除了智力障碍外，近80%的患者伴有心脏异常，包括动脉导管未闭（PDA）、间隔缺损、主动脉发育不良和心肌病等[13]。因此，我们假设THOC6可能直接影响心脏发育。尽管之前的研究主要关注THOC6的神经发育作用，但尚未证实THOC6与心脏发育之间的直接关联。

本研究通过敲除心肌细胞中的THOC6来初步探讨其在大心脏发育中的作用，并通过生物信息学分析和体外实验验证其功能。

部分内容

细胞培养

H9C2心肌细胞来源于ATCC（CRL-1446），并在含有10%胎牛血清（Gibco）、100 μg/mL链霉素和100 U/mL青霉素（Gibco）的DMEM/F-12培养基（Gibco, Canoga Park, CA）中培养。H9C2细胞在含有1% FBS（Gibco）和1 nM维甲酸（MedChemExpress，商品编号HY-14649）的分化培养基中分化14天。人类诱导多能干细胞（hiPSCs）来自Yulan实验室，培养在Matrigel（Corning）上。

建立THOC6敲除的H9C2细胞系

为了研究THOC6在H9C2细胞中的功能，我们使用针对exon2的特定sgRNA建立了THOC6敲除的H9C2细胞系。从H9C2细胞中分离基因组DNA进行基因型分析。通过PCR扩增DNA片段，然后使用引物5’-ggtccgtcatgggtaatgagac-3’进行测序。测序结果验证了突变细胞中的基因组编辑成功：THOC6敲除导致双链断裂（DSB）位点的胞嘧啶（C）缺失（图1A）。

讨论

THOC6作为保守的THO复合体的组成部分，在mRNA加工和输出、凋亡以及细胞周期调控中发挥作用[16]。已在BBIS患者中鉴定出多种THOC6突变[6]、[7]，研究主要探讨这些突变与智力障碍之间的关联[4]、[5]、[6]。大约80%的BBIS患者表现出心脏异常，包括结构缺陷和心肌病。这表明THOC6可能在心脏发育中起作用

结论

研究表明，THOC6的敲除会诱导心肌细胞凋亡并抑制细胞增殖。RNA-seq分析显示，THOC6缺失会导致与心脏收缩相关的蛋白质水平下降，尤其是I型胶原蛋白（COL1A1、COL1A2）和细胞骨架蛋白（ACTC1、β-微管蛋白）的表达减少。这些发现突显了THOC6在心脏功能中的关键作用，为进一步研究提供了有希望的方向

作者贡献声明

张希成：撰写、审稿与编辑、资金获取、概念构思。陈宏宇：方法学研究、实验设计。范向明：撰写、审稿与编辑、概念构思。李凤霞：软件使用、方法学研究。江子怡：资源获取、方法学研究。袁伟华：初稿撰写、项目管理、方法学研究、数据管理

伦理批准和参与同意

不适用。

利益冲突

作者声明没有利益冲突。

数据可用性

本研究的所有支持数据均包含在论文中。本研究生成的转录组数据可在线序列读取档案（GEO: GSE304302）中获取，包括原始数据、处理后的数据以及实验设计和测序的信息。

资助

本研究得到了浙江省自然科学基金（编号LQ24H020007）的支持。

利益冲突声明

? 作者声明以下可能被视为潜在利益冲突的财务利益/个人关系：张希成报告称获得了浙江省自然科学基金的财务支持。其他作者声明他们没有已知的可能影响本文工作的财务利益或个人关系。