《Forensic Science International》：Thermogravimetric analysis: A new tool for dating human teeth
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人类骨骼遗骸的年代判定是法医科学中的一项重大挑战。本研究旨在建立与拔牙后经过时间相关的年代区间与人类牙齿质量损失之间的关联，该质量损失通过热重分析在两种不同气氛下测定：空气和氮气。40颗健康人类牙齿在拔牙后于受控实验室条件下储存不同时间（0年、10年、25年、
人类骨骼遗骸的年代判定是法医科学中的一项重大挑战。本研究旨在建立与拔牙后经过时间相关的年代区间与人类牙齿质量损失之间的关联，该质量损失通过热重分析在两种不同气氛下测定：空气和氮气。40颗健康人类牙齿在拔牙后于受控实验室条件下储存不同时间（0年、10年、25年、50年；每组N=10）。研究人员对热重参数（总质量损失百分比，以及步骤1、步骤2和步骤3中的质量损失百分比）和热重参数导数（峰1、峰2和峰3处最大质量损失温度）进行了定量分析。二元逻辑回归和受试者工作特征（ROC）曲线分析被应用于评估这些参数区分10年、25年和50年代区间的能力。年代判定准确性在空气中始终高于氮气气氛。利用热重参数，研究人员开发了能够以高精度区分不同年代区间的预测公式。该方法在空气气氛中估算10年、25年和50年代区间时表现出优异性能，ROC曲线下面积（AUC）范围为0.95至1.00。研究结果突显了热重分析作为一种有前景的技术，能够准确估算受控条件下储存的人类牙齿拔牙后经过的时间。
本研究发表于《Forensic Science International》，旨在探索热重分析（Thermogravimetric Analysis, TGA）在人类牙齿年代判定中的应用潜力，以解决法医实践中长期存在的死后间隔时间（Post-Mortem Interval, PMI）估算难题。
研究背景方面，人类骨骼遗骸的年代判定一直是法医实践者面临的持续性挑战。确定死亡时间对于立法和调查目的至关重要，在法医死亡调查和人道主义危机中具有决定性意义。尽管经过数十年的研究，用于估算骨骼遗骸晚期PMI的准确可靠方法仍然缺乏。组织分解、骨骼遗骸视觉评估困难以及众多环境和内源性因素的影响，均降低了晚期PMI估算的准确性。目前应用于骨骼遗骸年代判定的晚期PMI方法包括多种定量生物标志物和大体形态学标志物的分析技术，如鲁米诺化学发光反应、放射性同位素测量、X射线衍射、荧光分析和振动光谱学等。然而，进一步研究仍是必要的，以实现人类骨骼遗骸中可靠的晚期PMI估算。由于骨骼遗骸（骨骼和牙齿）同时含有无机和有机成分，热重分析作为一种对质量变化敏感的技术，为评估死后变化提供了有前景的方法。在早期研究中，TGA已被用于表征骨骼和牙齿的热分解特征以用于法医目的。牙齿中的热分解产生约25.2%的总质量损失，分为三个明确的步骤：步骤1（44–210℃）对应自由水的损失，反映牙釉质、牙本质和牙髓的含水量；步骤2（211–603℃）与有机成分的燃烧相关，包括蛋白质降解（约270℃时释放二氧化硫）和330–347℃之间DNA残留的挥发，150–200℃之间发生严重的有机分解；步骤3（604–940℃）涉及无机成分，特别是羟基磷灰石的分解，突显了钙和磷酸盐在牙齿组织中的主导地位。尽管具有潜力，探索TGA作为晚期PMI估算工具的研究仍然稀少。最早将热重分析法应用于PMI估算的研究聚焦于区分新鲜骨骼与陈旧骨骼。后续研究检查了不同死后年龄（最长23个月）的猪骨在空气和氮气气氛下的变化，揭示了随死后年龄增加质量损失逐渐下降的趋势。然而，TGA尚未被用于研究人类牙齿的死后变化，尽管牙齿在法医、人类学或考古环境中经常被发现。研究人员指出，活体个体中的拔牙涉及牙周韧带和神经血管束的切断，导致牙齿死亡。因此，拔牙后经过的时间可作为牙齿死亡时间的替代指标。基于此，研究人员开展了这项先导性研究，使用在临床拔牙后于恒定实验室条件下储存的牙齿，模拟长期年代区间（0、10、25、50年），以评估TGA在空气和氮气气氛下是否能预测拔牙后经过的时间，从而为受控条件下的晚期PMI估算提供模型。
该研究具有重要意义，因为它首次将TGA技术应用于人类牙齿的年代判定，建立了可量化的预测模型，为法医人类学领域提供了一种全新的分析工具。如果经过进一步验证，该方法可能补充现有PMI估算技术的不足，特别是在涉及长期死后间隔的案件中。
研究人员为开展此项研究所用到的主要关键技术方法包括：样本来源于西班牙马拉加大学法医学系的存档牙齿标本队列，包括20名女性和20名男性，年龄29–82岁（平均60±11.54岁），牙齿因临床原因（牙周病或正畸治疗）拔除后，在21℃和65%相对湿度的气候控制室中密封储存0、10、25和50年；牙齿在低温条件下使用6770冷冻研磨机（SPEX CertiPrep Freezer Mill）粉碎成粉末；使用Mettler-Toledo TGA/DSC1热重分析仪（耦合ThermoStar
TM GSD 320质谱仪）进行热重分析，分别在空气（20 mL min
?1）和氮气（150 mL min
?1）两种气氛下，从30℃加热至1000℃，升温速率为10℃ min
?1；利用STARe v.16.00软件生成TG曲线和DTG曲线，提取TG参数（总质量损失百分比、步骤1/2/3质量损失百分比）和DTG参数（峰1/2/3最大质量损失温度）；采用ANCOVA模型（以捐赠者年龄为协变量）评估年代区间、气氛和性别效应，随后进行Tukey事后检验；通过Pearson相关分析探索参数间关联；建立二元逻辑回归模型并应用5000次成功重采样的bootstrap框架进行向后消除，以识别稳定预测因子组合，计算ROC曲线下面积（AUC）和总体分类准确率。
研究结果部分，研究呈现了以下主要发现：
TG和DTG光谱的定量差异分析表明，研究人员观察到年代区间、气氛和性别对热重参数存在显著影响。
年代区间对牙齿质量损失的影响方面，总质量损失百分比在不同年代区间之间存在显著差异。当分别分析三个热重步骤时，年代区间对步骤1和步骤2的质量损失百分比有显著影响，气氛对步骤2和步骤3的质量损失百分比有显著影响。在氮气气氛下，步骤2的质量损失较低而步骤3较高，与空气气氛相比。此外，在步骤3中发现年代区间与气氛之间存在交互作用，表明空气和氮气气氛下的步骤3质量损失百分比具有年代区间依赖性。DTG光谱分析显示，年代区间对峰1和峰3的最大质量损失温度有影响。在空气气氛下，10年、25年和50年代区间的峰1最大质量损失温度高于0年区间；在氮气气氛下，25年和50年代区间的峰1温度高于0年区间。相反，峰3的最大质量损失温度在空气气氛下的25年和50年区间较低，但在氮气气氛下未观察到此类变化。
性别特异性效应方面，当纳入性别作为判别因素时，观察到性别对总质量损失百分比有显著影响，女性显示较低的质量损失，在氮气气氛下的0年区间具有显著性。分别分析三个TG步骤时，性别效应特别出现在步骤1和步骤2，女性显示较低质量损失。按性别分组后，不同年代区间比较时观察到总质量损失百分比的显著效应，具体表现为步骤2质量损失百分比的年代效应。在两种性别中，空气气氛中有机物的燃烧更高，氮气气氛中无机物的分解更高，且这种效应与性别无关。DTG光谱的性别分析显示，年代区间、气氛和性别对峰1和峰3的最大质量损失温度有影响，气氛和性别对峰2温度有影响。男性牙齿在空气气氛下的10年、25年和50年区间峰1温度显著升高。女性牙齿通常在峰1、峰2和峰3显示较低温度。峰2和峰3观察到年代区间与性别的交互作用，表明这些峰的最大质量损失温度具有性别依赖性。
热重参数相关性受气氛和年代区间影响方面，Pearson相关分析表明，随捐赠者年龄增加而减少的质量损失在年代区间增加时变得不那么显著。在0年区间，捐赠者年龄与多项参数呈负相关，在空气和氮气气氛下均显著。与其他年代组相比，0年区间观察到更强的正相关，尤其是步骤1的质量损失与其他参数的相关性，且这些变化具有气氛依赖性。在空气气氛下，步骤2质量损失在0年和10年区间与其他参数显著相关，而在氮气气氛或25年和50年区间则不显著。除步骤3质量损失外，所有参数在两种气氛间均显示正相关。值得注意的是，在10年、25年和50年代区间，峰3温度在两种气氛间未发现显著相关性。
年代区间预测分析方面，二元逻辑回归选择了多个模型来预测各气氛下的年代区间。对于空气气氛，预测10年代区间的模型总体成功率为88.9%（AUC=0.95，敏感性=0.875，特异性=0.90），预测25年和50年代区间的模型总体成功率均为100%（AUC=1.00，敏感性=1.0，特异性=1.0）。预测概率分析表明，仅10年与0年区间存在均值差异。对于氮气气氛，最佳预测模型为25年区间（总体成功率94.1%，AUC=0.929），其次为50年区间（94.1%，AUC=0.885），10年区间模型表现较差（70.6%，AUC=0.757）。氮气气氛下，10年、25年和50年区间均与0年区间存在均值差异。
讨论部分，研究人员指出估算死亡后经过的时间是法医科学的关键但复杂挑战。本研究首次将TGA应用于人类牙齿样本，为在受控实验室条件下准确估算牙齿死亡后时间提供了潜在工具。然而，这些发现属于探索性，其在法医或人类学背景下的适用性需要进一步验证。诊断测试中AUC值大于0.9被认为"高度准确"，0.7–0.9为"对某些目的有用"，0.5–0.7为"差"。本研究开发的基于热重参数的模型在空气气氛中AUC值大于0.9，表明该方法可被视为估算10年、25年和50年代区间的高度准确方法。在氮气气氛中，该方法对25年区间高度准确，对10年和50年区间有一定用途。研究人员同时警告，尽管使用了bootstrap重采样来提高稳健性，但小样本量与模型选择程序的结合增加了过度拟合的风险，观察到的完美区分（AUC=1.00）可能无法反映真实的样本外性能。
研究人员将本研究结果与先前研究进行了比较，解释了与猪骨研究结果的差异：样本类型不同（猪骨 versus 人类牙齿）、骨骼与牙齿的成分差异、年代区间更长以及实验设计不同。本研究中步骤3的质量损失随年代区间变化，在氮气气氛下始终较高，表明无机成分在氮气环境中可能更易降解，尤其是较长年代区间的样本。先前关于氮气暴露骨骼的研究报告了更复杂的分解模式，质量损失与死后年龄之间无明确关系。
年龄和性别此前被报告为PMI估算的潜在调节因素。本研究观察到随捐赠者年龄增加质量损失减少，随年代区间增加该效应减弱，这可能由年轻个体较高的水和有机含量解释。性别也影响了多项TGA参数，但样本量不足以建立性别特异性预测模型。由于研究聚焦于长期区间，真实法医案件中的性别确定可能需要基因分析。研究样本仅包括后牙，但磨牙和前磨牙在釉质/牙本质比例、髓腔体积和表面积方面差异不大，混合后牙未增加采样异质性或干扰TGA差异的真实效应。
研究人员强调，埋藏条件、植物、动物、环境温度、土壤化学、湿度、降雨以及年龄和性别等个体特征均会影响分解过程。然而，牙齿因其高无机含量和颌骨内的保护而比骨骼更能抵抗死后降解、老化和外部环境。本研究的关键局限在于所有样本均在受控实验室条件下储存，无法评估真实法医场景中典型的环境变异性。与其他矿化样本的生物化学和结构分析类似，TGA需要破坏性取样，这在许多人身识别实验室中是标准做法。此外，X射线衍射和振动光谱等技术也需要专业实验室，限制了其常规法医或人类学应用。牙齿类型差异（前牙 versus 后牙）或健康与不健康牙齿之间的差异可能影响热重谱图。因此，需要进一步研究以确定TGA估算死后牙齿老化的可靠性和准确性，考虑环境条件、成岩变化和个体变异性等因素。
研究结论部分指出，热重分析揭示了人类牙齿总质量损失与所分析年代区间（0、10、25和50年）之间存在显著关联。个体的年龄和性别均影响总质量损失。在受控实验室条件下储存的人类牙齿在空气气氛中获得的热重参数，使开发能够区分10年、25年和50年代区间的预测模型成为可能。尽管这些参数在受控环境中有效区分了模拟储存区间，但这些发现应被视为初步结果。在将TGA推荐为真实法医或人类学背景下常规PMI估算工具之前，需要对具有已知法医PMI和暴露于各种环境及埋藏条件的牙齿进行广泛验证。总体而言，这些发现强调了热重分析作为人类牙齿年代判定新颖且潜在可靠技术的潜力，并支持需要进一步研究以确认其在真实法医场景中的适用性。
