靶向蛋白降解中内源蛋白复合物的贡献：基于CRBN的分子胶降解剂对CK1α-SACK1复合物的协同降解研究

《ACS Chemical Biology》：The Contribution of Native Protein Complexes to Targeted Protein Degradation

为解决靶向蛋白降解(TPD)中蛋白质功能依赖于其蛋白复合物环境这一关键问题，研究人员开展了关于分子胶降解剂(MGDs)如何影响CK1α及其支架蛋白SACK1家族复合物稳定性的研究。结果表明，强效CK1α降解剂DEG-77和SACK1不仅降解CK1α，还能协同降解与之相互作用的SACK1蛋白，此过程依赖于CK1α-SACK1相互作用、CUL4ACRBNE3连接酶复合物及蛋白酶体。该研究强调了POI的蛋白复合物背景是影响TPD效能与选择性的关键因素，为选择性降解特定蛋白复合物提供了新思路。

　　

在细胞这个精密运转的微观世界里，蛋白质很少独自行动，它们更倾向于“拉帮结派”，形成被称为多蛋白复合物或大分子复合物的功能团队。这种抱团行为让一个蛋白质能同时调控多个生物学过程。然而，当科学家们试图利用新兴的靶向蛋白降解（Targeted Protein Degradation, TPD）技术来精准清除细胞内的特定靶蛋白时，就面临一个有趣的问题：我们要降解的靶蛋白（Protein of Interest, POI），究竟是孤零零的个体，还是某个紧密团队中的一员？这个小分子降解剂诱导的E3连接酶和POI的“强制相亲”，是否会“误伤”与POI绑定的队友，导致所谓的“旁观者降解”或“附带损伤”？这正是当前TPD领域一个至关重要但常被忽视的方面。

针对这一问题，一篇发表于《ACS Chemical Biology》的研究将目光投向了丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶CK1α及其八位“搭档”——SACK1蛋白家族（原名FAM83A-H）。CK1α功能广泛，参与WNT信号传导、细胞分裂、DNA损伤应答等多个关键过程，而其多样化的功能很大程度上是通过与不同的SACK1蛋白结合，被“护送”到特定的细胞位置（如细胞膜、纺锤体、细胞质等）来实现的。那么，当使用源自来那度胺的强效CK1α分子胶降解剂（Molecular Glue Degraders, MGDs）来处理细胞时，这些靶向CK1α的“分子导弹”，是会精准地只消灭CK1α，还是会将其所在的整个蛋白复合物“一锅端”？

为了回答这个问题，研究人员开展了一系列深入探究。他们发现，两种高效的CK1α降解剂DEG-77和SACK1，不仅能有效降解CK1α本身，还能以相似的效力和动力学特征，协同降解与其紧密结合的SACK1F、SACK1G以及有丝分裂期的SACK1D蛋白，对SACK1B也有一定程度的降解效果。相比之下，其“前体”药物来那度胺虽也能微弱降解CK1α并完全降解SACK1F，但对其他SACK1蛋白影响甚微。这种协同降解现象在多种人类癌细胞系中均得到验证。机制研究表明，SACK1蛋白的降解严格依赖于CK1α的存在、CUL4A^CRBNE3泛素连接酶复合物以及蛋白酶体的活性。最关键的是，在源自掌跖角化病（Palmoplantar Keratoderma, PPK）患者的成纤维细胞中，由于致病突变SACK1G^R265P丧失了与CK1α结合的能力，尽管DEG-77仍能有效降解CK1α，却完全无法触动SACK1G^R265P。这强有力地证明，CK1α与SACK1蛋白之间的直接相互作用，是后者被“连带”降解的必要条件。该研究揭示了靶蛋白所处的天然大分子复合物环境是决定TPD结局（包括降解效率和潜在的旁观者降解）的关键因素，深化了我们对TPD机制的理解，并指出了通过设计降解剂来选择性靶向特定蛋白复合物，从而实现更精准调控的崭新前景。

在技术方法上，研究者综合运用了多种分子与细胞生物学手段。他们利用CRISPR/Cas9基因编辑技术构建了CRBN^–/–和CSNK1A1^–/–的基因敲除细胞系，以验证降解的机制依赖性。通过免疫印迹（Immunoblotting）进行蛋白表达水平检测和时间/剂量曲线分析，是评估降解效果的核心方法。免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation, Co-IP）被用于验证内源性CK1α与SACK1蛋白的相互作用。研究还使用了蛋白酶体抑制剂MG132和溶酶体抑制剂Bafilomycin A1来处理细胞，以确定降解途径。此外，定量PCR（qPCR）被用于分析mRNA水平变化，以排除转录调控的影响；而基于抗K-ε-GG抗体的泛素化肽段富集结合液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）的泛素化组学（diGly Ubiquitinomics）分析，则被尝试用于寻找降解诱导的泛素化修饰位点。研究中用到了包括DLD1、U2OS、A549、TOV-21G等多种人源癌细胞系，以及来自掌跖角化病患者（FIB04）和健康对照（FIB03）的成纤维细胞作为疾病模型。

研究结果

内源性CK1α-SACK1复合物在多种人细胞系中的评估

研究人员首先在DLD1、U2OS、A549和TOV-21G等细胞系中评估了内源性CK1α与SACK1蛋白的表达与相互作用。免疫印迹和免疫共沉淀结果显示，CK1α与不同的SACK1蛋白（如SACK1B、F、G、H）确实在细胞内形成复合物，其组合因细胞系而异。例如，在DLD1细胞中，CK1α与SACK1B、F、G、H共沉淀；而在有丝分裂期才与CK1α特异性相互作用的SACK1D，在异步生长的细胞提取物中则未被共沉淀，这与已知其互作具有细胞周期依赖性相符。

DEG系列CK1α降解剂降低多种SACK1蛋白水平

在DLD1细胞中测试DEG系列化合物（DEG-35, -48, -52, -54, -61, -64, -77）发现，它们对CK1α和不同SACK1蛋白的协同耗竭效果各异。其中，DEG-77和DEG-35能强效降解CK1α、SACK1F和SACK1G。重要的是，DEG-77在多种细胞系中均能引起CK1α、SACK1B、高磷酸化SACK1D、SACK1F和SACK1G的剂量依赖性和时间依赖性协同耗竭，而与CK1δ/ε也有结合的SACK1H则不受影响。来那度胺仅能微弱降解CK1α并完全降解SACK1F。qPCR结果排除了DEG-77引起上述蛋白水平下降是由于转录抑制的可能性。

SJ系列CK1α降解剂降低多种SACK1蛋白水平

类似地，SJ系列降解剂（SJ7095, SJ0040, SACK1）也能剂量依赖性地降低CK1α、SACK1B、SACK1F和SACK1G的水平。其中SACK1表现出与DEG-77相似的强效降解能力和协同降解动力学，能有效降解CK1α及其相互作用的SACK1蛋白。

不同CK1α降解剂协同耗竭SACK1蛋白能力的比较

对比几种降解剂发现，尽管都基于CRBN，但其协同降解谱不同。强效降解剂DEG-77和SACK1能强效协同耗竭SACK1B、F、G；来那度胺和另一种降解剂BTX161仅强效协同耗竭SACK1F；而SJ7095对SACK1F耗竭强，对SACK1G耗竭中等。这提示不同降解剂将特定的CK1α-SACK1复合物招募至CUL4A^CRBNE3连接酶机器的效率可能存在差异。

DEG-77和SACK1诱导的SACK1蛋白降解需要CK1α、CRBN和蛋白酶体

机制验证实验表明，在CRBN^–/–或CSNK1A1^–/–的DLD1细胞中，DEG-77或SACK1对SACK1B、F、G的耗竭被完全阻断，证明该过程同时依赖于CRBN和CK1α。蛋白酶体抑制剂MG132能完全挽救降解，而自噬-溶酶体抑制剂Bafilomycin A1则不能，证实降解是通过蛋白酶体途径进行的。泛素化组学分析初步显示，DEG-77处理可增强CK1α、SACK1G和SACK1B上特定赖氨酸残基的泛素化修饰。–/– and CSNK1A1^–/–DLD1 cells... (D, E) ... rescued when cells were pretreated with MG132 but not bafilomycin A1...">

DEG-77介导的CK1α-SACK1G协同降解需要两者间的直接相互作用

利用携带SACK1G^R265P致病突变（该突变破坏与CK1α结合）的掌跖角化病患者来源的成纤维细胞进行实验，提供了最直接的证据。尽管DEG-77在这些细胞中仍能有效降解CK1α，但完全不能降解无法与之结合的SACK1G^R265P突变体蛋白。而在对照成纤维细胞中，野生型SACK1G可被有效协同降解。在SACK1G^–/–细胞中回补表达野生型或突变型蛋白的实验进一步确认了这一结论。R265P while still degrading CK1α. (C) ... DEG-77 caused a robust reduction in levels of SACK1G-GFP ... it failed to deplete SACK1G^R265P-GFP...">

研究结论与意义

本研究系统阐述了以DEG-77和SACK1为代表的强效CK1α分子胶降解剂，能够通过CUL4A^CRBNE3连接酶-蛋白酶体途径，实现对其靶蛋白CK1α及其天然相互作用搭档——特定SACK1蛋白（如SACK1F、SACK1G、有丝分裂期SACK1D等）的协同降解。这种“旁观者降解”的发生，严格依赖于靶蛋白与其搭档之间直接的物理相互作用。

该研究的核心意义在于，它有力地强调了靶蛋白所处的“大分子环境”或“蛋白复合物背景”是影响靶向蛋白降解（TPD）效能与选择性的一个关键且此前未被充分重视的决定性因素。蛋白质在细胞中通常以复合物形式存在并发挥功能，降解剂在诱导E3连接酶接近靶蛋白时，实际上是在接近一个潜在的“蛋白团队”。这个团队的组成、结构、亚细胞定位等因素，都会影响所形成的三元复合物（POI-降解剂-E3）的“生产力”，从而决定降解的效率、动力学，以及是否会发生协同降解。

这不仅为理解不同免疫调节药物（IMiDs）衍生物对CK1α降解效力的差异提供了新的视角（例如，来那度胺效力较弱可能是因为某些CK1α-SACK1复合物无法与CUL4A^CRBN形成高效的三元复合物），也为TPD领域带来了新的机遇与挑战。一方面，“旁观者降解”提示了脱靶风险，在药物开发中需仔细评估。另一方面，它也开辟了一条全新的治疗策略：通过合理设计降解剂，有可能选择性地靶向并清除驱动疾病的特定蛋白复合物，而不影响该靶蛋白参与的其他生理性复合物，从而实现前所未有的精准调控。对于像CK1α这样具有多效性、难以用传统抑制剂选择性靶向的激酶，利用其与不同SACK1蛋白形成的特异性复合物作为靶点，为开发高选择性的疗法提供了崭新思路。