位点特异性修饰环状核糖核酸作为低免疫原性的多靶点微小核糖核酸海绵

《Journal of the American Chemical Society》：Site-Specifically Modified Circular Ribonucleic Acid Serves as Multitarget miRNA Sponge with Low Immunogenicity

　　

微小核糖核酸（microRNA, miRNA）海绵可通过竞争性结合细胞内过表达的miRNA调控下游基因表达，在miRNA靶向治疗中受到广泛关注。然而线性miRNA海绵在生理条件下稳定性低、免疫原性强。尽管人工环状核糖核酸（circular RNA, circRNA）作为miRNA海绵可提升生物稳定性，但其免疫原性问题仍未解决。2023年诺贝尔生理学或医学奖指出，引入修饰碱基可降低外源RNA的免疫原性，但实现circRNA的位点特异性修饰仍具挑战。研究人员开发了一种DNA模板介导的RNA连接法，用于合成携带多个miRNA结合位点的位点特异性修饰circRNA，可实现多种miRNA的长期共调控。基于此，研究人员发现30%假尿苷（pseudouridine, Ψ）修饰可在不依赖修饰位点或模式的情况下有效降低合成环状miRNA海绵的免疫原性。综上，该方法的高产率与位点特异性修饰能力可实现修饰circRNA的精准合成，通过工程化修饰连接区平衡免疫原性、生物稳定性与miRNA结合亲和力，这些进展将为新一代circRNA疗法开发提供支撑。

该研究由研究人员发表于《Journal of the American Chemical Society》，针对miRNA海绵与circRNA领域的现存瓶颈展开探索。研究背景显示，miRNA作为非编码小RNA，在mRNA降解、基因表达与细胞间信号传导中发挥不可或缺的作用，其失调与神经退行性疾病、心血管疾病及恶性肿瘤等多种疾病密切相关，是极具潜力的治疗靶点。miRNA海绵可通过竞争性结合多种类型与数量的miRNA，将其从靶mRNA上隔离从而负调控miRNA活性，但长链线性RNA海绵天然存在生物稳定性差、免疫原性高的缺陷，限制了生物医学应用。虽用circRNA替代线性RNA可提升稳定性，但免疫原性问题仍未突破。2023年诺贝尔生理学或医学奖已证实，核苷碱基修饰（如Ψ、N⁶-甲基腺苷（m⁶A））可消除外源RNA的炎症反应，这类修饰已被广泛用于mRNA药物以降低免疫原性并提升翻译效率，但现有修饰仅能以全替换或随机替换模式引入长链线性RNA，circRNA的位点特异性修饰因体外转录（in vitro transcription, IVT）与 permuted introns-exons（PIE）法的固有局限更具挑战，且随机修饰可能损害circRNA功能，例如m⁶A与N¹-甲基假尿苷（m¹Ψ）的甲基空间位阻会干扰碱基配对，降低miRNA结合位点与对应miRNA的亲和力。短链RNA虽可通过化学固相合成实现位点特异性修饰，但无法直接获得可作为miRNA海绵的circRNA，单链RNA环化相关研究也远少于单链DNA环化。

研究人员开展了基于模板导向连接法的位点特异性修饰circRNA合成研究，核心关键技术包括：DNA模板介导的双步RNA连接策略，通过T4 RNA连接酶2完成短RNA前体的线性连接，再通过Circligase实现线性中间体的分子内环化；化学固相合成短RNA前体以实现单碱基分辨率修饰；10%变性聚丙烯酰胺凝胶电泳（polyacrylamide gel electrophoresis, PAGE）、基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry, MALDI-TOF）与逆转录PCR（reverse transcription PCR, RT-PCR）联合表征circRNA结构；双荧光素酶报告系统与实时荧光定量PCR（quantitative real-time PCR, RT-qPCR）评估miRNA抑制效应与下游mRNA表达；位点特异性荧光标记circRNA追踪亚细胞分布；小鼠稳定巨噬细胞系RAW264.7评估不同Ψ修饰模式的免疫原性。

研究结果分为四部分。第一部分为基于模板导向连接的circRNA设计与合成。研究人员首先构建含两个miR-21结合位点、一个miR-221结合位点与一个miR-195结合位点的127 nt circRNA（circSPONGE），各结合位点间引入10 nt连接区以避免序列相互作用。线性连接步骤产率达约95%，环化步骤在含Mg²⁺或Ca²⁺缓冲液中效率达40%–50%，产物经脱氧核糖核酸酶I（DNase I）与RNase R序贯纯化后，经RNase H切割、RT-PCR与桑格测序验证，确证circSPONGE具有共价闭合环状结构与序列保真性。第二部分为MCF-7细胞中多种miRNA的沉默效应。体外组装实验证实circSPONGE可同时结合三种目标miRNA；双荧光素酶报告显示，circSPONGE对miR-21的吸附能力优于等量线性抗miRNA寡核苷酸（anti-miRNA oligonucleotide, AMO）混合物，且呈剂量依赖性，增加miR-221结合位点可提升其对对应miRNA的抑制效率；RT-qPCR结果显示，转染48小时后线性AMO组的下游mRNA表达已无显著变化，而circSPONGE仍可显著上调磷酸酶与张力蛋白同源物（phosphatase and tensin homolog, PTEN）、homeodomain-interacting蛋白激酶2（homeodomain-interacting protein kinase 2, HIPK2）与细胞周期蛋白E1（cyclin E1, CCNE1）的表达；稳定性实验证实circSPONGE在RNase R与胎牛血清中均表现出远高于线性前体的抗降解能力，最终实现对MCF-7细胞增殖的长效抑制。第三部分为位点特异性荧光基团修饰circRNA的合成。研究人员将FAM、Cy3、Cy5三种荧光基团分别引入不同短RNA前体，成功获得三荧光标记的circRNA，PAGE荧光扫描验证修饰位点保真；FAM标记的circSPONGE转染MCF-7细胞后，24小时与48小时均可在细胞核与细胞质中检出分布，符合其胞质miRNA调控的功能定位。第四部分为位点特异性假尿苷修饰降低circRNA免疫原性。研究人员设计合成了全Ψ替换（circ-33Ψ）、簇状10% Ψ修饰（circ-10Ψ）与分散11% Ψ修饰（circ-11Ψ）三类circRNA，在RAW264.7细胞中检测炎症因子表达。结果显示，Ψ修饰可显著降低circRNA免疫原性，30%修饰即可达到与全修饰相当的免疫抑制效果，且修饰模式对免疫原性无显著影响；双荧光素酶实验证实，不同Ψ修饰比例与模式均未损害circSPONGE的miRNA吸附功能。

讨论与结论部分指出，该研究开发的单锅法可实现单碱基分辨率的circRNA位点特异性修饰，突破了传统IVT与PIE法的修饰局限。circSPONGE作为多靶点miRNA海绵，凭借环状结构的稳定性优势，可长效协同抑制致癌miRNA，在复杂疾病治疗中潜力显著。位点特异性Ψ修饰可在不干扰功能的前提下高效降低免疫原性，避免了随机过量修饰的功能风险，还可兼容荧光标记等功能化修饰。该平台为定制化circRNA研发提供了通用工具，既推进了miRNA海绵疗法的发展，也为外源RNA免疫原性的精准调控奠定了基础，未来可进一步探索体内递送体系与临床转化路径，推动更安全高效的circRNA基精准医疗工具开发。