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本研究针对传统牵引力显微术(TFM)中荧光微珠作为基准标记在空间分辨率和细胞摄取方面存在的局限，引入了一种新型的DNA纳米结构（FluoroCubes）作为替代性基准标记。研究人员将其与RGD肽共锚定在聚二甲基硅氧烷(PDMS)基板上，结合改进的多通道光流算法，实现了更高的位移灵敏度和牵引力重建分辨率。这项工作为整合基于DNA的分子传感器、在生物界面探究分子尺度界面力提供了可重复的高分辨率方法。
细胞如何感知和响应其周围环境的机械力，是生命科学中的一个核心谜题。从胚胎发育、组织修复到免疫反应，细胞产生的力在许多生理和病理过程中都扮演着关键角色。为了“看见”这些无形的力量，科学家们发展出了牵引力显微术(Traction Force Microscopy, TFM)这一强大工具。其原理如同观察沙滩上的脚印：细胞如同行走在柔软的凝胶“沙滩”上，其施加的力会使“沙滩”变形，通过追踪嵌入其中的荧光微珠等“足迹标记”的位移，就能反推出细胞施加力的大小和方向。然而，这套经典方法在追求更精细的“视力”时遇到了瓶颈。传统使用的荧光微珠尺寸较大（通常40-200纳米），限制了标记密度和空间分辨率，使其难以看清亚细胞结构（如粘着斑）尺度下的精细力模式。此外，这些微珠容易被细胞吞噬，干扰测量，其引入也可能改变材料表面的局部力学性质。
与此同时，另一类基于分子的力传感器（如FRET张力探针、DNA力学探针）能够在刚性表面上报告单个蛋白质（如整合素）上的皮牛顿级力，实现了分子尺度的力测量。但这两种技术——描绘整体力图的TFM与测量单分子力的传感器——长期以来处于互补但分离的领域：前者擅长在柔软、可变形基板上绘制全细胞牵引力图，后者则通常局限于刚性表面。能否将两者的优势结合起来，在生理相关的软基板上同时获得高分辨率的整体力场和分子尺度的力信息呢？
近期发表在《Langmuir》上的一项研究，朝着这个愿景迈出了关键一步。研究团队摒弃了传统的荧光微珠，引入了一种名为DNA“荧光立方体”(FluoroCubes)的纳米结构作为全新的基准标记。这些边长仅约6纳米的DNA立方体上修饰了多个荧光染料，其大小与绿色荧光蛋白(GFP)相仿。研究人员将它们通过生物素-中性亲和素(Biotin-NeutrAvidin)化学键，与促细胞黏附的RGD肽共同锚定在可变形聚二甲基硅氧烷(PDMS)基板表面。为了验证并提升追踪精度，研究中还采用了与FluoroCubes发射光谱互补的荧光微珠进行双标记。在成像方面，研究利用了全内反射荧光(TIRF)显微术，这显著增强了小尺寸FluoroCubes的信噪比。最关键的是，研究人员开发了一种改进的Kanade–Lucas–Tomasi (KLT)光流追踪算法。该算法能够同时分析来自FluoroCubes和微珠两个荧光通道的图像信息，并通过跨通道相关性加权方案，优化了对相干运动的追踪，从而从高密度的标记中提取出更精确、更高分辨率的位移场。基于此位移场，再通过贝叶斯傅里叶变换牵引力细胞术(BFTTC)重建出细胞施加的牵引力分布图。
主要关键技术方法：研究构建了以PDMS为材料的软弹性基板，通过表面硅烷化、生物素化BSA和中性亲和素层层组装，实现了DNA FluoroCubes与RGD肽的稳定共固定。成像采用全内反射荧光(TIRF)显微术以优化信噪比。位移场分析基于一种改进的双通道Kanade–Lucas–Tomasi (KLT)光流算法，该算法能协同处理来自FluoroCubes和传统荧光微珠两个光谱通道的图像数据。牵引力重建则使用了贝叶斯傅里叶变换牵引力细胞术(BFTTC)。细胞实验使用了稳定表达GFP标记的kindlin-2蛋白的永生化小鼠肾成纤维细胞(KindKo+K2GFP)等细胞系。
研究结果
在PDMS基板上对FluoroCubes成像：研究表明，对于荧光信号较弱的FluoroCubes，与落射式荧光(EPI)照明相比，TIRF成像能极大提升其信噪比，使其在PDMS基板上能被清晰成像，这是实现高精度追踪的前提。
用FluoroCubes和微珠双标记基板：研究建立了一套模块化的表面功能化策略。PDMS基板经过氨基硅烷处理、生物素化牛血清白蛋白(BSA)钝化后，通过中性亲和素桥接生物素化的FluoroCubes。同时，通过碳二亚胺(EDC)化学将羧基化微珠和RGD肽偶联到基板表面。这种设计允许独立调节两种标记的密度，并确保细胞通过整合素与RGD肽特异性黏附。
改进光流追踪以提高双标记样品的牵引力分辨率：通过合成数据验证，研究发现简单地独立追踪两个通道或平均两个通道的图像均无法有效提升分辨率。而改进的双通道KLT算法，通过在其线性方程中串联两个通道的数据，并引入基于互相关系数的权重因子，能够显著减少追踪噪声，重建出更高保真度的位移场和牵引力场，为后续高分辨率TFM奠定了基础。
FluoroCubes在TFM实验中的光稳定性和适用性：长期成像测试表明，在连续TIRF照明下，FluoroCubes表现出足够的光稳定性，其荧光衰减趋势与微珠类似。关键的是，与容易被细胞摄取的微珠不同，FluoroCubes能稳定地锚定在基板表面，在细胞下方的分布均匀性更好（变异系数CV更低），几乎不被细胞内化。这消除了因标记物被细胞摄取而导致的追踪信号丢失或干扰问题，为长期、可靠的力测量提供了更优的基准层。
在标记有FluoroCubes和微珠的基板上进行高分辨率TFM：在实际细胞实验中，研究人员对表达GFP-kindlin-2的小鼠肾成纤维细胞进行了测量。分别从微珠通道和FluoroCubes通道获取的位移场具有高度一致性。利用改进的双通道KLT算法整合信息后，重建出的牵引力图分辨率更高、细节更丰富。重建出的牵引力与细胞粘着斑处聚集的kindlin-2-GFP荧光信号在空间上高度共定位，验证了该技术重建的力学信息的生物学相关性。研究证实，仅使用FluoroCubes作为基准标记，也能重建出可靠的牵引力图。
结论与讨论
该研究成功地将DNA纳米技术引入经典牵引力显微术，开发了一种基于DNA FluoroCubes的高分辨率TFM新平台。其主要结论和意义在于：
- 1.
实现了基准标记的革新：用尺寸仅约6纳米的DNA FluoroCubes替代了传统的微米/百纳米级荧光微珠。这种纳米级标记为达到更高的标记密度和空间分辨率提供了可能，并且因其单分散性好、表面修饰精准可控，对基板力学性质的扰动更小。
- 2.
建立了稳定、可靠的实验体系：通过生物素-中性亲和素化学，将FluoroCubes与RGD肽稳定共固定在PDMS基板上。该体系兼容TIRF成像，且FluoroCubes表现出良好的光稳定性和抗细胞摄取特性，解决了传统微珠易被内化的问题，确保了长期实验的可靠性。
- 3.
发展了高效的数据分析算法：提出的改进型双通道KLT光流算法，能智能融合来自不同光谱探针的信息，有效提升了在密集标记条件下位移场追踪的精度和分辨率，是发挥新型纳米标记优势的关键计算工具。
- 4.
展示了优越的整合与应用潜力：该工作不仅证明了FluoroCubes作为TFM基准标记的可行性，更重要的是，它搭建了一个“模块化”的平台。DNA纳米结构的可编程性意味着，未来可以很容易地将力传感模块、环境响应模块或其他功能单元集成到此类探针中。这为在同一个软基板实验系统中，同时实现宏观牵引力测绘和分子尺度力传感（即桥接传统TFM与分子张力探针技术）奠定了方法学基础，有望提供从细胞整体到单个粘附分子的多尺度力学视图。
总之，这项研究超越了传统TFM的范式，通过融合DNA纳米技术、先进显微成像和计算算法，为在生理相关软物质界面上解析纳米尺度的细胞力学提供了强有力的新工具，推动了细胞力学生物学向更精细、更集成化的方向发展。
