《Frontiers in Oncology》：Comprehensive profiling of alternative splicing and immune landscapes in rectal cancer: implications for mRNA vaccine design and immune subtype stratification
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为了应对肿瘤疫苗开发中抗原预测困难和免疫原性低等挑战，研究人员通过分析TCGA-READ等公共数据，系统性鉴定了由可变剪接事件和移码突变产生的潜在新抗原（如FAM135A），并基于免疫特征将直肠癌患者分层为C1/C2两种亚型。研究发现FAM135A可作为候选mRNA疫苗靶点，且C2亚型患者可能对CTLA-4/PD-1抑制剂治疗更敏感。该研究为开发新型直肠癌mRNA疫苗及实现精准免疫治疗提供了重要指导。
癌症治疗领域，mRNA疫苗正成为一颗冉冉升起的新星，其在抗击新冠（COVID-19）中的成功应用，让人们对它在肿瘤免疫治疗中的潜力寄予厚望。然而，要将mRNA疫苗成功应用于癌症治疗，还面临着两大“拦路虎”：首先是如何精准找到那些只存在于肿瘤细胞、且能有效激发免疫系统攻击的“身份证”——即肿瘤特异性抗原（TSA）；其次是肿瘤内部通常存在一个抑制免疫反应的“冷”微环境，这使得疫苗难以唤醒沉睡的免疫大军。特别是对于直肠癌这种全球健康负担沉重的恶性肿瘤，尽管手术、放化疗等手段不断进步，晚期患者的预后依然严峻，对现有免疫检查点抑制剂（ICB）的反应也有限，因此，开发新的治疗策略迫在眉睫。
近期，一篇发表在《Frontiers in Oncology》上的研究，为我们带来了破局的新思路。研究人员独辟蹊径，将目光投向了肿瘤细胞内一个复杂的生物学过程——可变剪接（Alternative Splicing）。在基因转变为蛋白质的过程中，RNA前体（pre-mRNA）会经历“剪接”，去除无用的内含子，连接有用的外显子。这个过程并非一成不变，同一个基因可以通过不同的剪接方式，产生多种蛋白质异构体，这就是可变剪接。而在癌细胞中，这个精细调控的过程常常出错，产生大量异常剪接产物。有趣的是，这些“错误”产物，如果能够逃逸细胞内的“质检”系统（如无义介导的mRNA降解，NMD），就可能被呈递到细胞表面，成为能被免疫系统识别的新抗原。这为疫苗开发提供了全新的靶点来源。为了探索这一可能性，并解决直肠癌免疫治疗的困境，研究团队开展了一项系统的生物信息学研究，旨在从异常剪接事件中“淘金”，寻找有潜力的疫苗抗原，并在此基础上描绘直肠癌的免疫图谱，为精准分层治疗铺路。
为了开展这项研究，研究人员整合运用了多项关键技术方法。首先，他们从多个公共数据库获取了核心数据：从TCGA Splice-Seq数据库获取直肠癌（READ）的可变剪接数据（以百分比剪接指数PSI值衡量）；从Xena GDC Hub和cBioPortal数据库获取TCGA-READ队列的基因表达谱、突变数据、临床及生存信息；并从GEO数据库获取了GSE87211数据集用于外部验证。基于这些数据，研究运用了一系列生物信息学分析流程：利用Wilcoxon秩和检验筛选肿瘤与正常组织间差异显著的异常剪接事件；通过差异表达分析结合移码突变数据，并与癌症免疫图谱（TCIA）数据库的HLA结合预测交叉，来筛选潜在新抗原；利用CIBERSORT、ssGSEA等算法评估肿瘤免疫细胞浸润水平；采用ConsensusClusterPlus和NMF等共识聚类方法，基于预后相关免疫基因对患者进行免疫亚型分型；并运用WGCNA构建基因共表达网络以识别预后相关枢纽基因。此外，还通过SubMap算法预测了不同亚型对免疫检查点抑制剂的潜在反应。
分析结果部分如下：
异常剪接事件分析
研究人员在TCGA-READ数据中检测到了七种类型的异常剪接事件。结果显示，外显子跳跃（ES）是最常见的剪接类型，而互斥外显子（ME）则最为罕见。在肿瘤样本中，共鉴定出4480个上调事件和3328个下调事件，这表明肿瘤组织中存在显著的剪接模式改变。
筛选差异表达基因和潜在抗原
通过对差异表达基因、异常剪接基因和移码突变基因进行交集分析，研究人员锁定了217个潜在的抗原候选基因。进一步的生存分析和免疫相关性评估聚焦于三个关键基因：FAM135A、GAR1和CDIPT。其中，FAM135A在TCGA队列中与较差的总体生存期（OS）显著相关，并且其表达与B细胞、巨噬细胞和髓系树突状细胞的浸润呈正相关，提示其具有较高的免疫原性。在TCIA数据库的预测中，FAM135A编码的肽段能与人白细胞抗原（HLA）分子结合，进一步支持其作为新抗原的潜力。
免疫亚型分类
基于预后相关免疫基因的共识聚类分析，TCGA-READ患者被清晰地划分为两个免疫亚型：C1和C2。生存分析显示，两个亚型患者的预后存在显著差异，这一发现在独立的GSE87211数据集中得到了验证。NMF聚类和PCA分析进一步证实了该分型的稳健性。临床特征分析发现，C2亚型患者中发生病理淋巴结转移（N1/N2期）的比例显著高于C1亚型。
两种亚型的免疫活性分析
对两个亚型的免疫微环境进行深入剖析发现，它们在多个维度上存在显著区别。C2亚型表现出更高的免疫活性评分，并且多个免疫检查点（ICP）基因、免疫原性细胞死亡（ICD）调节基因和无义介导的mRNA降解（NMD）相关因子的表达与C1亚型不同。在免疫细胞构成上，两个亚型在免疫评分、基质评分、肿瘤纯度和溶细胞（CYT）评分上均有差异。
免疫景观表征
通过单样本基因集富集分析（ssGSEA）和伪时间轨迹分析，研究进一步描绘了肿瘤免疫微环境的动态连续变化。分析发现，处于轨迹不同极端位置的样本组其预后存在显著差异，并且最初的C1和C2亚型还可以根据其在降维空间中的位置进一步细分为具有不同生存结局的亚群。这些亚群在28个泛癌免疫细胞亚群的富集分数上也表现出显著差异，揭示了肿瘤微环境的高度异质性。
利用WGCNA筛选预后相关枢纽基因并构建风险模型
通过加权基因共表达网络分析（WGCNA），研究人员构建了TCGA-READ的基因共表达网络，并从中鉴定出与预后相关的模块。从这些模块中进一步筛选出24个枢纽基因，并基于其表达构建了风险评分模型。根据中位风险评分将患者分为高风险组和低风险组，生存分析显示两组预后差异显著，且风险评分在预测1年、3年和5年生存率方面表现出良好的诊断性能（ROC曲线下面积AUC最高达0.93）。
不同亚型的免疫治疗疗效分析
这是研究中最具临床转化潜力的发现之一。通过SubMap算法预测，C2亚型肿瘤对CTLA-4和PD-1抑制剂治疗产生潜在反应的比例显著高于C1亚型。为了佐证这一预测，研究人员检查了与免疫检查点抑制剂（ICB）临床反应密切相关的干扰素-γ（IFN-γ）特征，发现C2亚型的IFN-γ评分显著高于C1亚型，表明其肿瘤微环境处于更活跃的T细胞 inflamed状态。值得注意的是，两个亚型在经典的预测性生物标志物——微卫星不稳定性（MSI）状态和肿瘤突变负荷（TMB）水平上并无显著差异，这提示基于免疫基因表达的亚型分型可能提供超越传统标志物的新预测维度。
归纳研究结论与讨论
本研究的结论清晰而有力。首先，它成功地将异常剪接事件与肿瘤新抗原发现联系起来，系统性地筛选出FAM135A作为一个极具前景的直肠癌mRNA疫苗候选靶点。FAM135A在肿瘤中高表达、与不良预后相关，并且与抗原呈递细胞（APC）浸润正相关，这使其兼具了肿瘤特异性和高免疫原性的双重优势。其次，研究基于全面的免疫基因谱，将直肠癌患者划分为C1和C2两种具有显著不同预后和免疫微环境特征的亚型。C1亚型呈现出“免疫热”表型，可能对旨在激活免疫的mRNA疫苗更为敏感；而C2亚型虽然整体免疫抑制更强，但其肿瘤微环境中存在更强的T细胞 inflamed信号（如高IFN-γ评分），并且预测对CTLA-4/PD-1等免疫检查点抑制剂治疗更为敏感。这一发现至关重要，因为它为“冷”肿瘤（通常对ICB无反应）中识别出可能获益的亚群提供了新思路。
该研究的意义深远。它首次在直肠癌中，通过整合异常剪接和突变数据来筛选mRNA疫苗抗原，为破解肿瘤抗原稀缺的难题提供了创新方法。所建立的免疫亚型分层框架，不仅超越了传统TNM分期和MSI/TMB等标志物的局限，实现了更精准的预后预测，更重要的是，为未来实施个体化联合免疫治疗策略指明了方向。例如，针对C1亚型患者，可优先测试以FAM135A为靶点的mRNA疫苗；而对于C2亚型患者，则可能考虑将mRNA疫苗与免疫检查点抑制剂联用，以期协同增效。当然，研究团队也客观指出了本研究的局限性，包括结论完全基于生物信息学分析，亟需后续的湿实验（如T细胞激活实验、动物模型）和前瞻性临床试验来验证FAM135A的免疫原性及亚型分层的临床预测价值。尽管如此，这项研究无疑为直肠癌的免疫治疗，特别是mRNA疫苗的研发，绘制了一幅详尽的“战略地图”，为将实验室的发现转化为临床患者获益
