利用高性能表面增强拉曼光谱基底对活癌细胞进行无标记的恶性特性分析 Jiwon Yun, Hyeim Yu, Youngho Yun, Wonil Nam

《Micromachines》：Label-Free Malignancy Phenotyping of Living Cancer Cells by High-Performance Surface-Enhanced Raman Spectroscopy Substrates Jiwon Yun, Hyeim Yu, Youngho Yun and Wonil Nam

　　摘要 表面增强拉曼光谱（SERS）通过将分子置于等离子体纳米结构的近场中，放大拉曼散射，从而实现无标记的分子指纹识别。尽管这种方法对活细胞表型分析非常吸引人，但许多细胞SERS研究依赖于内化的胶体纳米颗粒，这导致吸收和定位的变化、聚集引起的热点波动以及潜在的细胞干扰。在这里，我们报道了一种类似芯片的Au/SiO2纳米层压SERS基底，该基底支持在空间定义的热点上直接培养活细胞并进行无标记测量，而无需纳米颗粒的吸收。这种周期性纳米层压结构形成了密集的纳米间隙，并针对785纳米的激发波长进行了工程设计，能够在较大的、适合细胞培养的区域内提供均匀的增强效果，并且具有高的热点均匀性。通过调节细胞-基底纳米-生物界面，该平台能够在不受拉曼标签影响的情况下，在生理条件下复现地获取细胞的内在振动指纹。使用MCF-7和MDA-MB-231乳腺癌细胞，我们收集了每条 hundreds of spectra 的数据，其中MDA-MB-231表现出更广泛的光谱变化，表明其异质性更大。主成分分析（PCA）和线性判别分析（LDA）对MCF-7和MDA-MB-231的分类准确率达到了99%，并且明场成像确认了细胞的附着性和典型形态。这种基于芯片的无标记活细胞SERS平台能够实现可扩展的、非干扰性的表型分析，并可能支持在细微的癌症状态下快速进行恶性分类和治疗反应筛查。

1. 引言
表面增强拉曼光谱（SERS）是一种无标记的振动光谱技术，它可以放大位于等离子体纳米结构近场中的分子的拉曼信号，从而实现高灵敏度的分子指纹识别 [1,2,3,4,5,6]。SERS已广泛应用于化学传感、环境监测、食品安全以及生物医学分析和诊断 [7,8,9,10,11,12,13,14]。在生物医学领域，SERS被广泛用于目标生物标志物的检测、疾病诊断和生物成像，既包括直接的无标记传感，也包括基于表面功能和拉曼标签的间接策略 [15,16,17,18,19]。SERS在细胞和单细胞研究中发挥了重要作用，与荧光读数相比具有实际优势，如窄光谱带、最小的光漂白效应以及能够提供内源性生物分子的内在化学信息 [20,21,22,23,24]。例如，Spedalieri等人使用胶体金纳米星作为细胞内SERS探针来分析细胞内环境，他们发现纳米星的形态会影响内体隔室内的细胞内处理过程和蛋白质冠层，从而实现对细胞内纳米-生物相互作用的敏感SERS读数 [25]。Xu等人提出了一种使用碘化物改性的银纳米颗粒和超快线照明拉曼映射的无标记活细胞识别工作流程，实现了正常细胞和癌细胞的准确分类 [26]。Zhang等人通过工程化金纳米颗粒以结合葡萄糖氧化酶和拉曼报告分子，开发了一种可穿透细胞的SERS纳米反应器，将细胞内的葡萄糖转化为可测量的SERS信号 [27]。然而，大多数细胞SERS方法仍然依赖于功能化的胶体纳米颗粒作为内部探针。这些方法存在一些反复出现的问题，如细胞吸收和定位的不均匀性、潜在的细胞毒性或细胞生理干扰，以及不受控制的聚集，这增加了热点的变异性 [28,29,30,31,32]。

为了克服这些问题，已经开发了类似芯片的固体SERS基底，这些基底能够在允许细胞直接在等离子体纳米结构上培养的同时提供空间定义的热点，从而减少对胶体纳米颗粒吸收的依赖并提高测量的稳定性。直接的无标记SERS可以通过探测等离子体热点内分子集合体的内在拉曼特征来进行细胞研究，无需化学修饰，从而从活的生物系统中获得信息丰富的光谱指纹。例如，Nikelshparg等人开发了一种基于固定在载玻片上的聚集金纳米星的平面SERS基底，实现了对活细胞的直接测量。他们表明，长的纳米星尖端可以穿透细胞膜，从而在没有依赖自由胶体内化的情况下实现活细胞内分子成分的无标记SERS读数 [33]。Plou等人报道了一种由Au纳米颗粒超晶格构成的等离子体基底，在芯片格式中提供了密集且可重复的热点。他们展示了利用代谢物的不同振动指纹进行多路SERS检测，而无需细胞吸收纳米颗粒 [34]。我们之前还展示了对背景折射率变化不敏感的SERS基底，用于活细胞的无标记拉曼分析和分类。该平台支持大面积基底，与传统细胞培养兼容，并在保持良好热点均匀性的同时提供高SERS性能 [35]。虽然这种方法能够清晰区分两种细胞系，但概念验证研究仅限于容易区分的类别（如正常细胞与癌细胞），而没有涉及与实际生物和临床应用更相关的细微表型差异。

在这里，我们使用培养在芯片型等离子体基底上的具有不同侵袭性的乳腺癌细胞模型（MCF-7和MDA-MB-231）展示了基于无标记活细胞SERS的恶性分类，建立了一个不需要胶体纳米颗粒内化的测量框架。通过利用之前的纳米层压SERS平台，该平台能够在解决密切相关的癌细胞之间的细微差异方面推进恶性表型分析。具体来说，我们利用了一个经过工程设计的细胞-基底纳米-生物界面，在膜接触区域形成密集且空间定义的等离子体热点，从而实现细胞内在振动指纹的复现获取。因为无标记的细胞SERS信息丰富但本质上具有高维性和异质性，我们应用了多变量分析（PCA）结合线性判别分析（LDA），以捕捉超出手动单峰解释的细微、分布式的光谱差异，并提高对来自局部热点采样和细胞-基底耦合的光谱变化的鲁棒性。通过这种方法，我们从数百个活细胞光谱中实现了MCF-7和MDA-MB-231的高精度区分，同时保持了细胞在基底上的形态，从而在基于芯片的格式中支持生物相容性和分类性能。这些结果突出表明，结合光谱分析设计纳米-生物界面可以实现实用的无标记细胞SERS分类，为更真实的表型研究提供了途径。

2. 材料与方法
SERS基底制造：使用软光刻技术复制了纳米柱图案的硅母版，然后使用这种压模在柔性聚酯薄膜上模制出UV固化的聚氨酯（PU）纳米柱阵列，随后在80°C下进行UV固化热固化。接下来，通过电子束蒸发沉积了由四个Au层（每层30纳米）和三个SiO2层（从底部到底部分别为6纳米、8纳米和12纳米）组成的交替Au/SiO2多层结构。最后，用缓冲氧化物蚀刻剂（10:1）稍微蚀刻SiO2层，以暴露基于纳米间隙的等离子体热点。

细胞培养：MDA-MB-231细胞从Sigma-Aldrich（美国密苏里州圣路易斯）获得，并在含有4 mM谷氨酰胺、10%胎牛血清（FBS）和青霉素-链霉素的F12:DMEM培养基中生长。MCF-7细胞在含有10% FBS和2 × L谷氨酰胺的EMEM培养基中生长。细胞在37°C和5% CO2的湿润空气中培养。然后将细胞用胰蛋白酶处理并接种在纳米层压SERS基底上。

SERS测量：我们使用共聚焦拉曼显微镜（Thermo Fisher Scientific，美国马萨诸塞州沃尔瑟姆）在785纳米激光激发下获取SERS光谱。使用20倍水浸物镜（NA = 0.5），激光功率为5毫瓦，积分时间为10毫秒。校准基于硅峰进行。

多变量分析：随后进行了宇宙射线去除、背景减除、平滑插值和数据截断。主成分分析（PCA）和峰值提取分别在R软件（版本4.5.1，R Core Team，奥地利维也纳）中使用ChemoSpec和MALDIquant包进行。线性判别分析（LDA）使用R包MASS进行。

有限差分时域（FDTD）模拟：使用Ansys Lumerical（版本2020 R2.1，加拿大不列颠哥伦比亚省温哥华）的FDTD解决方案进行光学模拟。所有方向都使用了2纳米的网格。金的光学常数取自Johnson和Christy的数据。在x和y方向上使用了周期性为400纳米的Bloch边界条件，在z方向上使用了完美匹配层边界条件。SiO2和PU的折射率分别设定为1.5和1.56。

3. 结果
图1示意性地展示了本研究的整体工作流程和核心概念。活的乳腺癌细胞直接培养在类似芯片的纳米层压SERS基底上，其中细胞膜贴合表面地形，并在细胞膜界面处的密集分布的等离子体热点近场内定位生物分子。在近红外激光激发下，这个界面允许无需引入胶体纳米颗粒或拉曼标签即可实现无标记的SERS获取活细胞的内在振动指纹。由于得到的细胞SERS光谱信息丰富但具有异质性，且不容易通过少数几个单一峰来解释，我们进行了多变量分析以提取光谱差异，并使用主成分分析（PCA）结合线性判别分析（LDA）进行恶性相关分类。在这项工作中，我们将这种方法应用于具有不同侵袭性的乳腺癌模型（MCF-7和MDA-MB-231），证明了基于芯片的无标记SERS是一种通过工程化纳米-生物界面进行表型区分的实用工具。

图1. 无标记SERS获取活乳腺癌细胞以进行恶性表型分析的示意图。突出的纳米结构可以诱导膜-热点界面，从而实现多变量分析所需的振动指纹信息的获取。
图2a显示了纳米层压SERS基底的代表性光学照片。简要来说，纳米层压SERS基底是通过结合软光刻、纳米压印光刻和物理气相沉积来形成周期性聚合物纳米结构，然后通过共形沉积交替的金-介电层（Au-SiO2）来创建富含纳米间隙的纳米层压特征。详细的制造过程在其他地方有描述 [35]。在图案化区域观察到的明显衍射质量上表明了纳米结构的周期性和高度均匀性，而插图显示了没有衍射的暗外观。
图2b提供了扫描电子显微镜（SEM）图像，证实了纳米层压特征的高度周期性阵列，具有均匀的间距和几何形状，这与通过纳米压印在晶圆尺度上的复制一致。
图2c显示了从400纳米到1300纳米的纳米层压基底的有限差分时域（FDTD）计算反射光谱，以及多层堆栈的示意图横截面。由于金在约520纳米处表现出强烈的带间跃迁 [36]，这会增加光学损失并降低可见光谱带中的等离子体响应，因此我们设计了多层厚度以支持在785纳米左右的近红外带中的共振行为。此外，大约860纳米处的多共振特征与生物分子的斯托克斯位移拉曼带重叠，从而提高了整个指纹窗口内的整体收集效率。
图2d显示了在785纳米处计算的近场分布|E|2，揭示了在纳米层压结构侧壁形成的纳米尺度间隙中的强场局部化。当细胞膜贴合基底表面地形时，这些间隙在物理上是可访问的。计算出的最大|E|2值为3.5 × 10^3，对应的SERS增强效应约为10^7，符合常用的|E|4近似 [37]。这个值与测量到的SERS增强因子约10^7一致 [30]。与这种设计一致，该基底在多次测量中显示出高均匀性和可重复的SERS响应 [38]。
图2. 纳米层压SERS基底的表征。(a) 纳米层压SERS基底的照片。插图从不同角度展示了基底。(b) 顶视图SEM图像，(c) 纳米层压结构的FDTD计算反射光谱，(d) 785纳米处|E|2的空间分布图。
图3显示了活乳腺癌细胞在纳米层压SERS基底上的明场图像。细胞直接培养在SERS基底上，无需表面功能化。我们选择了MCF-7和MDA-MB-231作为基准乳腺癌模型，这两种细胞模型代表了不同的分子亚型和侵袭性表型，从而能够在生物学上有意义的恶性水平范围内评估无标记活细胞SERS测量。MCF-7是一种ER/PR阳性的A型管腔细胞，通常被视为转移率较低、侵袭性较低的乳腺癌模型 [39,40,41]。相比之下，MDA-MB-231是一种三阴性细胞，广泛用作具有高度侵袭性和侵袭性的模型，具有间充质样表型特征 [42,43]。这对细胞常用于比较上皮样和间充质样的行为及其侵袭性程度。明场图像显示，MCF-7和MDA-MB-231细胞在SERS基底上保持良好的附着性并扩散，没有明显的细胞圆形化、膜起泡或表面脱落，这些通常是粘附培养中急性细胞死亡和细胞毒性压力的常见形态学指标 [44,45]。MCF-7（图3a）细胞呈现多边形的上皮样形态，并形成紧密的菌落，而MDA-MB-231（图3b）细胞则呈现更细长的梭形形态，细胞间凝聚力较低，突起更明显。这些特征与MCF-7相对较低的侵袭性上皮表型和MDA-MB-231较高的侵袭性间充质表型相符[43,46]。图3显示了活乳腺癌细胞的明场图像：（a）MCF-7和（b）MDA-MB-231。我们对直接培养在SERS基底上的活乳腺癌细胞（MCF-7和MDA-MB-231）进行了无标记SERS测量。每个样本在100 μm × 100 μm的映射区域内使用100 μm × 100 μm的网格采集了光谱数据。经过预处理和质量控制后，保留了417个MCF-7细胞的光谱和433个MDA-MB-231细胞的光谱用于后续分析。图4a和图4b分别显示了MCF-7和MDA-MB-231的平均SERS光谱（实线），阴影带表示光谱的5%到95%区间。值得注意的是，MDA-MB-231的光谱显示出比MCF-7更宽的百分位数范围，表明在相同的测量条件下其光谱异质性更大。这种增加的异质性与MDA-MB-231更具有侵袭性的间充质表型一致，可能反映了其内在生化多样性的结合。尽管存在这种变异性，两种细胞系在指纹区域仍显示出可重复的光谱特征。图4显示了活乳腺癌细胞的代表性平均SERS光谱及其5%和95%区间以及生物分子特征峰：（a）MCF-7和（b）MDA-MB-231。光谱数量分别为417（MCF-7）和433（MDA-MB-231）。505 cm?1处的峰归属于蛋白质中的二硫键（S–S）振动，在MDA-MB-231细胞中的强度略高于MCF-7细胞。二硫键是膜相关和细胞外蛋白质中的常见结构特征，其SERS强度的变化可能反映了细胞表面蛋白质组成或结构组织的差异。因此，MDA-MB-231中观察到的增强信号可能与更具侵袭性的表型中蛋白质组织的变化或细胞外基质的重塑有关[47]。646 cm?1处的峰归属于酪氨酸相关的蛋白质振动，在MDA-MB-231中也相对增强。酪氨酸残基经常存在于膜蛋白和信号相关分子中，其相对强度的变化可能表明膜蛋白丰度或局部分子环境的差异。这种增强可能反映了两种细胞类型之间膜相关蛋白质组成的差异[48,49]。此外，1050–1500 cm?1的光谱区域包括多个与CH2变形和不饱和脂质振动相关的峰，在MDA-MB-231细胞中的整体强度高于MCF-7细胞。该区域通常与细胞拉曼光谱中的膜磷脂和脂肪酸相关分子结构相关。因此，这一脂质相关区域信号的增加可能表明膜脂质组成或组织的差异，可能反映了更具侵袭性的细胞系的代谢和结构特征的变化[50,51]。手动逐峰解释有助于确定主要的生物分子峰，但在无标记细胞SERS中，由于多种原因，这往往不足以准确区分细胞状态。首先，细胞光谱是高维且高度拥挤的；因此，许多峰相互重叠，代表了蛋白质、脂质、核酸和代谢物的混合贡献。其次，由于热点采样效应和细胞-基底接触的异质性，绝对甚至相对峰强度可能会变化，使得单峰指标容易受到测量变异性和异常值的影响。第三，细胞系之间的表型差异通常表现为多个波数的微妙、分布式的变化，这些变化难以用有限的精选峰集捕捉到。因此，我们应用了多变量分析来充分利用整个光谱指纹，并以无偏见的方式提取主要的变异结构。

为了评估从培养在SERS基底上的细胞获得的无标记SERS指纹是否足以用于表型区分，我们对MCF-7和MDA-MB-231细胞的光谱进行了多变量分析。PCA是一种无监督的降维方法，它将相关的光谱变化总结为少数几个正交成分。由于PCA是一种不显式最大化类别间分离的无监督方法，因此提取的PCA分数被用作LDA的输入特征。在这项研究中，保留了24个主成分，解释了总光谱方差的95%。然后LDA使用这些简化特征来识别一个最大化类别间分离的投影，从而产生一个较少依赖于任何单个拉曼峰且对光谱强度波动更为鲁棒的定量分类器。无监督PCA提供了光谱方差的概览，并在PC1-PC2空间中揭示了两个对应于两种细胞系的主要簇（图5a）。然而，部分点存在部分重叠（插图），这与预期的生物异质性和细胞-基底界面的局部变异性一致。图5显示了活乳腺细胞的多变量分析：（a）两种乳腺细胞类型的PCA分数图。（b）比较不同恶性程度的组的PCA-LDA分数图。（c）基于PCA-LDA的分类混淆矩阵。然后我们对PCA降维后的特征应用LDA（PCA-LDA）以最大化类别间分离，得到了明显分开的LD分数（图5b）。为了严格估计分类性能并尽量减少过拟合，我们采用了留一法交叉验证（LOOCV），其中将一个光谱作为测试样本，而PCA-LDA模型则在所有剩余光谱上训练。这个过程迭代进行，直到每个光谱都被用作测试一次。如图5c所示，最终的分类器的准确率分别为MCF-7的99.8%和MDA-MB-231的99.5%，证明了无标记SERS测量能够保留足够的分子指纹信息来区分两种具有不同表型的乳腺癌细胞模型。

在这项工作中，我们展示了直接培养在芯片型纳米层压SERS基底上的活乳腺细胞的无标记恶性表型分析，从而避免了胶体纳米粒子的吸收。纳米层压结构提供了大面积、高度均匀的热点，并在785 nm处进行了光学优化，以实现强大的近场增强，从而在保持基底上典型细胞形态的同时，可重复地获取细胞固有的振动指纹。使用每类数百个活细胞光谱，我们观察到了明显的群体水平光谱差异，其中更具侵袭性的表型显示出更大的异质性。通过PCA-LDA，我们在MCF-7和MDA-MB-231之间实现了高分类精度，支持基于芯片的SERS作为无标记细胞分类的实际平台。仍有几个机会可以推进这一平台，以实现更现实的生物学和转化应用。首先，除了二元分离外，该方法应扩展到更细微的表型分类，包括中间状态、药物诱导的情况以及临床上相关的细胞内变异性，方法是通过扩展到多个细胞系和患者来源的模型来实现的。其次，为了确保鲁棒性和泛化能力，未来的研究应纳入独立的外部测试集，并明确量化批量效应，例如基底之间的、每日之间的以及操作者之间的变异性，这些需要标准化协议的支持。最后，与更高通量的采集集成将有助于将光谱分类与潜在的生化机制联系起来，使基于芯片的无标记细胞SERS朝着实用的表型分析工作流程发展。总体而言，这项工作支持基于基底的活细胞SERS作为癌症生物学及相关应用中可扩展的无标记表型筛选的方法。