一种用于连续分离多组分微粒的级联双螺旋微流控芯片 张然轩、 刘婷、 赵建龙、 蔡高哲

《Micromachines》：A Cascaded Dual Spiral Microfluidic Chip for Continuous Separation of Multicomponent Microparticles Renxuan Zhang, Ting Liu, Jianlong Zhao and Gaozhe Cai

　　摘要 惯性微流控技术在高效、无标记的连续分离多组分微粒子方面具有巨大潜力。然而，传统的单螺旋微通道难以分离三种或更多类型的粒子，而依赖护套流体或多台泵的传统级联系统则面临操作复杂性的增加。为了解决这一问题，我们提出了一种基于被动流动阻力匹配的级联双螺旋微流控芯片。该芯片仅由一台注射泵驱动，无需护套流体，即可实现三种粒子类型的连续分离。芯片中嵌入了一个自适应流动阻力网络：第一阶段的通道保持高速度，通过强大的惯性升力优先捕获大粒子；随后流体通过预定的几何阻力进入第二阶段，实现自动减速。实验表明，在1.6 mL/min的流速下，该系统能够连续分离15 μm、10 μm和5 μm三种微粒子的1:10:10混合样本，其中15 μm粒子的回收率达到92%，10 μm和5 μm粒子的收集纯度分别超过98%和99%。这种纯被动式流体架构简化了级联分离过程，为复杂多组分样品的预处理提供了可靠的工程解决方案。

1. 引言
通过尺寸对复杂多组分微粒子进行连续分离在生物医学诊断、环境监测和工业粉末分类等领域具有重要的应用价值[1,2]。传统的离心或微孔过滤方法通常存在固有的缺点，如容易堵塞、通量有限以及可能对微粒子样品造成机械损伤[3,4,5]。近年来，微流控技术在微观尺度上展示了精确的流体操控能力，因此成为在不使用标记的情况下高效分离微粒子的理想平台[6,7,8]。在各种微流控分离技术中，基于螺旋微通道的惯性微流控技术受到了广泛关注，这得益于其结构简单、处理通量大且易于无缝集成[9,10]。在弯曲的微通道中，由于离心效应，流体会产生一个垂直于主流方向的次级流（即Dean涡流）。微粒子在Dean阻力力和剪切诱导的惯性升力的共同作用下发生定规律的侧向迁移，最终在特定的横向平衡位置形成稳定的聚焦流线[11]。这项技术已被证明能够有效分离尺寸差异足够的样品混合物[12,13]。

然而，在实际应用中，复杂样品往往包含三种或更多尺寸相近的组分。在传统的单螺旋通道中同时分离多种尺寸的微粒子是一个严重的流体动力学挑战。具体而言，作用在微粒子上的惯性升力与其直径的四次方成正比，而Dean阻力力仅与其直径成正比[14]。在相对较高的流速下，大粒子（例如15 μm）主要受惯性升力的作用，能够迅速在通道内壁附近形成稳定的聚焦。相比之下，对于中等和小型粒子（例如10 μm和5 μm），其惯性升力随尺寸减小而显著减弱，因此它们的轨迹更容易受到次级Dean流扰动的影响而分散。因此，在相同的流速条件下，中等和小型粒子的流线容易重叠，使得单一流场结构难以同时实现高效聚焦和分离。

为了克服单通道的理论瓶颈，研究人员提出了级联微流控的概念，即通过串联不同几何特性的通道来实现多阶段分离[15,16,17]。在现有的级联微流控研究中，多个分离模块的串联连接改变了内部压力分布，通常需要在级联节点引入额外的缓冲入口以主动补偿流速。然而，多个流体入口增加了系统的复杂性。此外，确定最终操作参数通常依赖于对各个模块的初步实验评估，随后通过流速模拟和广泛的实验参数扫描来确定最佳流速组合，这一过程本质上是经验性的优化。此外，护套流力的引入不可避免地稀释了初期稀有的目标样品，可能限制其在实际预处理中的应用[18,19,20]。

为了解决这些流体动力学和系统集成方面的挑战，本研究提出了一种基于被动流体动力阻力匹配的单入口级联双螺旋微流控芯片。与依赖多台泵进行主动补偿的系统不同，我们的设计提供了一种确定性和定量化的流体控制方法。整个系统完全由一台注射泵驱动，无需护套流体，大大减少了对外部硬件的依赖，所需泵送设备减少了超过一半。第一螺旋阶段出口处的流速分配比由下游分支的相对流体动力阻力被动控制。预先设计的阻力网络使后续螺旋通道能够平滑地达到各自的target流速。这种方法消除了平衡样品流和护套流时常见的不确定性和操作复杂性。

首先通过单螺旋通道中的粒子轨迹实验确定各个螺旋阶段的最佳操作流速。这些结果随后用于指导流体动力阻力网络的设计。在级联螺旋微流控芯片的设计阶段，通过初步计算得出流动分配比的解析预测。随后通过数值模拟来验证整体稳态流场和相应的流动分配比。因此，这种方法实现了从经验性试错到定量正向设计的转变，提高了设备的理论严谨性和工程的可转移性。实验结果表明，在1.6 mL/min的入口流速下，该系统成功分离了初始浓度比为1:10:10的15 μm、10 μm和5 μm聚苯乙烯微粒子。第一阶段的高速通道实现了92%的大粒子（15 μm）回收率，第二阶段通道则利用被动减弱的流场有效捕获了10 μm和5 μm背景粒子，其收集纯度分别超过98%和99%。这种基于被动流体动力阻力匹配的单入口级联双螺旋微流控芯片降低了多阶段分离系统的硬件要求，为复杂微粒子的连续分离提供了可靠且可转移的工程解决方案。

2. 材料与方法
2.1 芯片设计和工作原理
图1展示了本研究开发的级联微流控芯片的架构。该设备在单个平面上集成了两个连续的螺旋微通道，分别设有一个入口和三个独立的出口，用于收集15 μm、10 μm和5 μm微粒子。为了防止样本粒子在螺旋惯性微流控通道内物理堵塞，并确保15 μm和10 μm粒子的堵塞比a/Dh > 0.07（其中Dh为通道的水力直径，定义为a/Dh = 2wh/(w + h)），螺旋通道的矩形横截面设计为宽度w为200 μm，高度h为60 μm。每个螺旋通道包含2个环路，最小曲率半径R为7.4 mm。这种特定设计提供了足够有效的聚焦长度，以实现稳定的粒子分离。同时，它避免了一阶段螺旋中的过度流体阻力，从而防止级联后系统总阻力的增加。从空间上看，系统采用反向配置：初始通道中的液体从中心向外螺旋流动，其外出口与同一水平面上的后续通道内入口无缝连接，使液体以相反方向向内螺旋流动。此外，在两个阶段之间的连接处以及最后一个螺旋的末端加入了局部加宽和不对称的分岔结构。位于阶段之间的内部分支用于收集15 μm微粒子，该分支采用延长的几何形状以增加流体阻力（见第3.2节）。

图1. 级联双螺旋微流控芯片的几何结构和特征尺寸示意图。(a) 第一阶段末端的示意图，15 μm、10 μm和5 μm粒子分别用红色、绿色和蓝色表示；(b) 第二阶段末端的示意图；(c) 芯片图像，包括一个样品入口和三个出口；(d) 双螺旋设计的整体俯视示意图；(e) 螺旋通道横截面、阶段间连接和二级分支尺寸的示意图。螺旋微通道是连续分离微粒子最常用的核心结构之一[21,22,23]。在螺旋惯性微流控通道中，微粒子的侧向迁移行为主要由净惯性升力（FL ∝ a^4）和次级流诱导的Dean阻力力（FD ∝ a）之间的相互作用控制[24,25,26,27]。惯性升力FL的大小与微粒子直径的四次方和最大流体速度的平方成正比，表达式如下[28,29,30,31]：
FNet,L = f??^2(Re,x/h)?ρ???^2???a^4Dh^2
其中??是流体密度，Um是通道中心的最大速度（对于矩形通道，通常定义为Um = 1.5 U，U是平均流体速度），a是微粒子直径，fL是取决于微粒子位置和通道雷诺数的升力系数。

在较高的雷诺数(Re)下，在弯曲通道内会产生一个垂直于主流方向的次级流，这种现象称为Dean流，它由流体惯性的空间变化驱动[32,33,34]。次级Dean流表现为通道横截面上下区域中一对反向旋转的对称涡流。Dean流的强度可以通过无量纲Dean数(De)来评估[32,33]：
D_e = (???^2/R)^1/2?R^e
这种次级流会对悬浮的微粒子施加Dean阻力力(FD)，其近似计算公式为[33,35]：
FD ≈ 5.4×10^(-4)πμD^(1.63)e
其中μ表示流体的动力粘度。Dean阻力力将粒子卷入对称旋转的涡流中，而惯性升力则倾向于将粒子限制在横截面内的特定平衡位置。因此，这两种力的相对大小决定了粒子的最终动态行为。可以引入一个无量纲参数Rf来表征惯性升力和Dean阻力力之间的竞争关系：
Rf = 2a^2??D^3 > 0.08
研究表明，当Rf满足上述条件时，惯性升力可以有效地克服Dean阻力力，实现粒子的聚焦。计算得出的15 μm和10 μm粒子的Rf值均大于0.08，其中15 μm粒子的Rf值更大。这验证了设计的通道横截面能够有效聚焦这两种粒子尺寸。此外，这也动态解释了为什么15 μm粒子会在螺旋通道内壁附近建立其聚焦平衡位置[36,37]。

三种尺寸粒子在微通道内的迁移机制存在显著差异。由于5 μm粒子难以保持有效的聚焦状态，它们在次级流扰动下产生的发散轨迹容易与其他粒子的聚焦流线发生空间重叠，尤其是10 μm粒子。因此，单个螺旋通道无法同时高效分离这三种粒子类型。此外，小于5 μm的微粒子同样难以保持有效的惯性聚焦，可能会污染15 μm粒子的分离纯度。因此，该螺旋微通道有效处理的微粒子最小尺寸限制约为5 μm。

基于这一理论依据，我们提出了一个级联双螺旋结构。在第一阶段通道中设置高流速，以优先且稳定地分离15微米的颗粒，这些颗粒主要受惯性升力的作用。随后，含有10微米和5微米颗粒的混合物被引导进入第二阶段通道。在第二阶段，通过被动流动阻力匹配自动降低流速。由于惯性升力随流速的平方减弱（FL ∝ U2），而迪恩阻力（FD ∝ U）的减弱则更为平缓，并且螺旋通道的曲率从外侧向内侧逐渐增加，因此力比（FL/FD）显著减小。这种机械机制的变化有效地削弱了惯性升力对小颗粒（5微米）的影响，增强了迪恩次级流动在它们侧向迁移中的主导作用。结合通道末端加宽的出口设计，利用流线的几何发散效应适度放大10微米和5微米颗粒之间的侧向距离。这最终实现了复杂混合物的高效三组分分离。

在微尺度层流系统中，分叉网络内的流动分布行为可以类比经典的欧姆定律（如图2所示）[38]。当体积流速为Q的流体通过两端有压降?P的微通道时，等效流体阻力（Rh）满足以下关系：

Q = ΔPRh （5）

图2. 级联微流体芯片中分叉连接处的等效流动阻力网络物理模型示意图。阶段之间的不对称分叉在流体动力学上等效于并联电路。由于所有芯片出口都保持在大气压力下，这些并联分支的压降是相同的。因此，分叉处的流动分布比由两路径之间的流体阻力倒数决定 [39,40]：

Q1/Q2 = R?2/R?1 （6）

R? ≈ 1/2 * χ * ωLw * ?3[1 ? 192 * ω5 * ωtanh(ωω2 * ?)] （7）

每个分支的流体阻力可以使用矩形通道的哈根-泊肃叶近似方程 [41] 计算。在通道高度恒定的情况下，流体阻力（Rh）主要由物理通道宽度（W）和流长（L）决定。tanh是双曲正切函数，用于校正矩形横截面边缘的粘性阻力。当样品通过第一阶段通道时，较大的微颗粒沿着内壁流动并进入内高阻力分支，而较小的微颗粒与大部分流体一起进入第二阶段通道。通过调整内部延长分支的几何尺寸来预设阻力比，系统可以自适应且直观地调节两个分支之间的流动分布。在第3.1节中，根据单个螺旋通道的最佳操作流速确定分叉处的流动分割比。一旦建立了这个预设的流动分割比，就可以确定15微米收集分支与第二阶段入口分支之间的流体阻力（Rh）比（第3.2节）。这样实现了无需外部泵或阀门干预的被动流动减速。

2.2. 芯片的制造

采用了标准软光刻技术来高精度制造微流体芯片。首先，通过旋涂将SU-8负性光刻胶沉积在干净的单晶硅晶圆表面上。按照包括软烘烤、紫外（UV）曝光、后烘烤和显影的标准光刻程序，成功制作出目标通道高度为60微米的SU-8母模。随后，将聚二甲基硅氧烷（PDMS）预聚物及其固化剂以10:1的质量比充分混合。然后将混合物放入真空干燥器中脱气以完全去除内部气泡。脱气的PDMS混合物均匀倒入SU-8模具中，并在65°C的烤箱中固化2小时。固化后，小心地从硅模板上剥离含有微通道图案的PDMS副本。使用专用打孔器在预先设计的流体入口和收集出口处打孔。最后，将打孔后的PDMS芯片和干净的玻璃载玻片放入氧等离子清洗器中进行表面活化。处理后立即将两者接触，施加重压以实现PDMS芯片与玻璃基板之间的永久共价键合。

2.3. 样品制备

为了物理模拟复杂真实样本中存在的尺寸和浓度上的极端差异，使用了标准聚苯乙烯荧光微球（Huge Biotechnology，上海，中国）作为多组分悬浮系统的测试模型。实验中使用了直径分别为15微米（绿色荧光）、10微米（红色荧光）和5微米（蓝色荧光）的颗粒。关于浓度梯度，模拟大尺寸稀有目标的15微米颗粒的工作浓度设置为5 × 10^4颗粒/mL。同时，代表背景群体的10微米和5微米颗粒的浓度都设置为5 × 10^5颗粒/mL。这种设计严格保持了混合系统的初始浓度比为1:10:10。为了防止聚苯乙烯颗粒的物理聚集，样品悬浮液在1 × 磷酸盐缓冲盐水（PBS）中均匀制备。加入体积分数为0.1% (v/v) 的Tween-20以有效降低流体表面张力并抑制非特异性吸附。作为一种高度稀释的水溶液，其在室温下的流体动力学性质几乎与纯水相同。具体来说，动态粘度约为1.0 × 10^-3 Pa·s，流体密度约为1000 kg/m3。在化学性质方面，1 × PBS保持稳定的生理pH值为7.4，电导率约为16 mS/cm。在每次样品注入之前，将装有混合物的离心管放在超声水浴中超声处理5分钟，确保所有尺寸的颗粒都以完全单分散的状态进入微流体系统。

2.4. 数值模拟设置

进行了三维有限元数值模拟，以验证级联流体阻力网络中的流动分割比。这些模拟使用了COMSOL Multiphysics软件（版本6.3）包。采用了层流物理接口，流体介质设定为室温下的不可压缩去离子水（密度ρ = 998.2 kg/m3，动态粘度μ = 1.003 mPa·s）。关于边界条件：在微通道入口处施加指定的体积流速；级联系统的所有终端出口均设置为零相对静压边界以实现自由流出；并且对芯片的所有内部物理壁施加无滑移边界条件。为了准确解决由弯曲通道和靠近壁面的陡峭速度梯度引起的迪恩涡流边界层，整个壁面区域实施了边界层网格细化。最后，使用了大约203万个元素的优化网格配置进行稳态流场求解，以实现计算精度和资源消耗之间的最佳平衡。

2.5. 实验设置和数据量化

在微流体分选实验中，将制备好的混合微颗粒悬浮液装载到标准医疗注射器中，然后使用高精度微注射泵（LSP02 2B，Longer Precision Pump，保定，中国）以恒定流速连续注入级联微流体芯片。实时实验观察平台主要由一台倒置荧光显微镜（ICX41，SOPTOP，宁波，中国）组成，该显微镜配备了一个高灵敏度相机（M3LY500TFS，LITO，深圳，中国）。该设置用于记录微颗粒在级联微通道内各个位置的高速荧光运动轨迹。这些动态过程作为补充材料提供。捕获的多通道原始荧光图像随后被导入ImageJ软件（版本1.53）进行定量分析。系统提取了相对荧光强度的空间分布曲线。通过计算主要峰值的质心坐标和半高宽（FWHM），准确量化了侧向聚焦位置和聚焦带宽。所有流速条件都保持超过2.5分钟，观察在颗粒轨迹稳定后进行。为了最终评估分选性能，收集每个芯片出口的流出物，并使用血细胞计数器（Shanghai Qiujing，上海，中国）在显微镜下对目标微颗粒进行物理计数。系统的分选效果通过两个核心指标进行量化：分离纯度和回收率。纯度定义为特定出口中目标尺寸微颗粒的百分比，相对于该出口收集到的总颗粒数。回收率定义为特定出口中收集到的目标尺寸微颗粒的百分比，相对于注入入口的总颗粒数。为了确保结果的可靠性和可重复性，所有微流体分选实验至少独立重复三次（n = 3）。重复实验的定量数据以平均值 ± 标准差（SD）的形式呈现。

3. 结果和讨论

3.1. 单个螺旋通道中的侧向迁移

最初使用了一个与级联设备截面相同的独立螺旋微通道作为初步测试平台。该设置用于表征多组分微颗粒的惯性聚焦行为并确定最佳分离参数。实验系统研究了15微米、10微米和5微米荧光颗粒在通道末端的空间迁移行为。这些测试的入口驱动流速范围从0.1 mL/min到1.8 mL/min。

在第一阶段通道中，将15微米、10微米和5微米荧光聚苯乙烯微颗粒的悬浮液泵入测试芯片，入口流速梯度从0.1到1.8 mL/min（图3a）。15微米和10微米微颗粒满足了临界聚焦阈值a/Dh > 0.07，因此能够在流场内形成明显的聚焦带[24]。由于惯性升力与迪恩阻力的物理比与颗粒直径的立方成正比（FL/FD ∝ a3），因此作用在15微米微颗粒上的惯性升力绝对占主导地位。因此，它们的聚焦质心迅速向通道内壁迁移，在靠近内壁的位置显示出高度聚焦的状态。10微米微颗粒的力相对较小；在超过1.4 mL/min的流速下，它们的平衡位置稳定分布在距离内壁稍远的外围区域[37]。相比之下，5微米微颗粒的物理尺寸尚未达到强惯性聚焦的临界条件。在较低流速下，5微米微颗粒经历了轻微的流场扰动，导致分布带相对较窄。然而，随着流速的持续增加，通道内的曲率诱导的次级迪恩流动显著增强[36]。由于5微米微颗粒上的惯性升力相对较小，它们无法抵抗高流速下的显著迪恩阻力扰动。结果，这些颗粒被涡流带走并分散在横截面中，导致轨迹分布带宽显著增加。

图3. (a) 不同尺寸（15微米、10微米、5微米）微颗粒在第一阶段通道中不同入口流速下的荧光轨迹演变；(b) 微颗粒的侧向质心位置与入口流速之间的定量关系。图3b中的空间分布轮廓展示了三种微颗粒的迁移情况。在1.6 mL/min的入口流速下，15微米微颗粒在靠近内壁的位置形成了一个相对狭窄的聚焦带。这在15微米颗粒与分布在外围区域的10微米和5微米颗粒之间创建了一个足够的物理间隙。在这个特定流速下，大颗粒与中、小颗粒之间的空间重叠达到最小，为有效分离提供了坚实的基础。因此，本研究确定了1.6 mL/min作为初始螺旋通道的最佳操作流速。然而，在这一特定流速条件下，10 μm和5 μm微粒的空间轨迹存在显著重叠，使得有效分离变得困难。由于单一流速场不足以同时分离所有三种粒径的微粒，剩余的混合物必须被引导进入后续的级联通道进行进一步处理。在第一阶段通道中无法区分10 μm和5 μm微粒，因此进一步测试了第二阶段的单一螺旋通道，以研究低流速下微粒的侧向迁移行为。系统中只引入了这两种类型的微粒。入口流速梯度保持在0.1至1.8 mL/min之间。定量实验数据显示，微粒的侧向迁移位置对流速变化非常敏感（图4a）。在较低流速下，5 μm和10 μm微粒都向通道内侧迁移，彼此重叠。随着流速逐渐增加，流场中的次级涡流效应增强，导致两种尺寸的微粒都向通道外侧移动。在这个动态演变过程中，由于10 μm微粒仍受到向内的惯性升力的限制，它们的向外移动速度相对较慢。相比之下，5 μm微粒主要受 Dean 阻力的影响，因此其向外迁移更为明显[30]。这种机械上的侧向移动速率差异逐渐产生了两者之间的分离间隙（图4b）。当流速进一步增加时，两种微粒继续向通道外壁移动，使它们的分布区域再次重叠，分离间隙减小。最终，本研究确定0.8至0.95 mL/min为第二阶段螺旋微通道的最佳分离工作流速范围。在这些特定流速下，10 μm和5 μm微粒的质心距离达到相对最大值。这为使用扩展的通道几何形状进一步放大它们的物理分离效果奠定了最佳流体动力学基础，最终实现了高纯度的收集。

3.2 流动阻力网络的定量设计
如前所述，第一阶段和第二阶段螺旋通道的最佳操作流速分别为1.6 mL/min和0.9 mL/min。为了实现这种流速分布，在分叉处采用了细长的几何结构作为内侧15 μm收集分支。这种细长结构的横截面形状和面积与主螺旋通道相同。在分支设计中，它被安排成环绕第一阶段螺旋通道。其通道长度是主要可调参数，直到级联设备能够达到与各个组件相同的流体动力学特性。根据方程（6），分叉处的流速分布与两个下游分支的流体阻力倒数成正比。为了达到最佳目标流速，15 μm收集分支与第二阶段入口分支之间的理想流体阻力比应约为1.29。这为后续的通道几何设计提供了定量指导原则。基于矩形通道的Hagen Poiseuille近似方程（方程（7）），我们定量评估了第二阶段入口分支的总水流阻力（Rh2）。该分支包括一个逐渐变窄的过渡连接段（宽度从400 μm线性减小到200 μm，长度=21.0 mm）和一个连续的螺旋段（宽度=200 μm，中心线长度=114.9 mm）。通过对过渡段应用Simpson规则进行数值积分，确定该分支的总水流阻力为4.40 × 1013 Pa·s/m3。同样，我们也评估了内侧15 μm收集分支（Rh1）。为了确保计算精度，将该收集分支分为两部分：一个初始的狭窄部分（宽度=100 μm，中心线长度=1.4 mm）和一个随后的加宽部分（宽度=200 μm，中心线长度=174.4 mm）。由于微通道内的流体严格处于层流状态，通道宽度扩大引起的局部压力损失可以忽略不计。应用串联阻力模型，计算出该分支的精确水流阻力为6.09 × 1013 Pa·s/m3。总之，系统的实际设计阻力比（Rh1/Rh2）约为1.38（接近预期的设计值1.29）。根据方程（6），这个特定的阻力比决定了分叉处的精确流速分布：大约41.9%的流体被导向15 μm收集出口，而剩余的58.1%进入第二阶段。这意味着在总入口流速为1.6 mL/min的情况下，第二阶段螺旋通道的实际操作流速约为0.93 mL/min。这一结果与最佳目标流速0.9 mL/min高度吻合，并且在可接受的工程误差范围内，充分证明了被动流速匹配设计的合理性和有效性。

3.3 CFD流场模拟和流速分配验证
为了验证上述理论设计的有效性，我们使用COMSOL Multiphysics软件研究了整个集成芯片中的流速分布。前一节中使用解析公式进行的流体动力学阻力初步计算为我们的设计提供了定量基础和初步指导。然而，在实际的3D螺旋通道中，由离心力引起的强Dean涡流（次级流）会导致额外的动能耗散。因此，可以通过三维稳态流场模拟来确定流速分配比。如图5c所示的流速分布图所示，流体在第一阶段螺旋通道内保持相对较高的流速。当流体到达阶段间加宽区域和不对称分叉节点时，流体经历了显著的物理衰减。这种效应是由通道横截面积的突然增加以及通过阻力网络的流体分流所引起的。

图5. 通过COMSOL Multiphysics执行的流速模拟结果。（a）第一阶段独立螺旋通道的流速模拟（对应于1.6 mL/min的流速分布）；（b）第二阶段独立螺旋通道的流速模拟（对应于0.9 mL/min的流速分布）；（c）级联双螺旋通道中的最佳流速分布，表明级联通道内关键节点的流速分布与每个独立通道的流场特性非常相似。为了精确量化流场分布比，进一步基于流速模拟采用了表面积分函数分析，成功提取了每个出口截面的实际体积流速。Q=???(u?nx+v?ny+w?nz)dS（8），其中Q表示分支的体积流速，S表示出口截面积。变量u、v和w是笛卡尔坐标系中的实际速度分量，而nx、ny和nz表示截面的单位法向量的分量。在总入口驱动流速为1.6 mL/min的情况下，流体通过第一阶段分叉网络。内侧高阻力收集分支（出口I）成功分流了0.695 mL/min的流体，占总系统注入量的大约43.4%。同时，剩余的约0.905 mL/min的流体（占56.6%）被引入第二阶段螺旋通道。这证明了依靠预置的几何结构比例，系统可以在不使用外部微泵/阀门或鞘液的情况下实现精确的流速减速。经过适应性减速后，流体在第二阶段的螺旋通道中流动，并在末端附近的加宽区域分流。出口II和出口III的实际输出体积流速分别为0.191 mL/min和0.714 mL/min。系统所有分支出口的流速之和与总入口流速高度一致，符合质量守恒定律。值得注意的是，模拟的流速分配比（43.4%）与分析预测（41.9%）略有偏差。这种可忽略的差异是预期之中的，因为3D数值模型综合考虑了次级Dean涡流引起的额外动能耗散，而理想的Hagen-Poiseuille方程没有考虑这一点。

3.4 级联芯片的分选性能
在观察了流场轨迹并验证了级联系统中的流速分布后，对芯片的三向回收率和分选纯度进行了定量分析。芯片的总入口流速保持在1.6 mL/min。平均流速超过2 m/s，从初始注入到稳定聚焦和最终出口收集的整个分离过程仅在几十毫秒内完成。这突显了其连续和超高的处理能力，实现了每小时1.0 × 10?个颗粒的总处理容量，这对实际应用至关重要。一旦系统流场稳定，就定期收集第一阶段15 μm收集端口（出口I）、第二阶段10 μm收集端口（出口II）和5 μm收集端口（出口III）的流出物。如图6c的荧光轨迹所示，大多数10 μm颗粒被导向出口II，而5 μm颗粒主要流向出口III。这一点通过收集到的颗粒的荧光显微镜图像得到了进一步确认，图像显示出口II主要包含10 μm颗粒（图6a），出口III主要包含5 μm颗粒（图6b）。此外，分布在三个出口的15 μm颗粒的荧光图像表明它们主要在第一阶段出口I被收集（图6d）。从这三个出口收集的物理样品悬浮液如图6e所示。图6. 使用混合颗粒（15 μm, 10 μm, 5 μm）测试了级联螺旋微流体芯片。（a）从出口II收集的颗粒的荧光显微镜结果；（b）从出口III收集的颗粒的荧光显微镜结果；（c）出口II和III的荧光迹线；（d）三个出口中15 μm颗粒的分布；（e）从每个出口收集的物理样品的比较。对级联螺旋微流体芯片的分选回收率（f）和纯度（g）进行了定量分析，分析了三种尺寸的混合微粒（15 μm, 10 μm, 5 μm，初始比例为1:10:10）。使用自动细胞分析仪对从每个出口收集的悬浮液样品进行了浓度和粒径分布统计。然后将这些测量数据与初始混合悬浮液的颗粒浓度进行比较。这些数据被代入之前定义的评估公式中，计算出15 μm、10 μm和5 μm颗粒的回收率以及它们在各自收集端口的分离纯度。统计数据显示，第一阶段分离端口对15 μm微粒的回收率为92.0% ± 5.5%。第一阶段和第二阶段之间的加宽结构有效减少了杂质颗粒的混入。收集部分中15 μm颗粒的绝对浓度为（1.06 ± 0.08）× 10?颗粒/mL。与初始的5 × 10?颗粒/mL相比，浓度富集因子（CEF）超过了2倍。15 μm颗粒的比例从最初的4.76%（1/21）增加到17.3% ± 1.4%，纯度富集因子（PEF）约为3.6倍。因此，系统成功满足了第一阶段连续预富集的标准，有效地从大量背景中提取了稀有目标颗粒。在第一个分叉阶段，15微米微粒的实时动态过程及其稳定的流线形成得到了验证。在第二阶段的分离过程中，10微米和5微米微粒在减速流场中的侧向移动存在显著差异。由于在第二阶段末端分叉前结构加宽，10微米目标微粒在第二阶段通道中的回收率达到了82 ± 8.0%，而出口II的收集纯度高达98.0 ± 0.8%。同时，出口III成功地将绝大多数5微米背景微粒（回收率为73.0 ± 7%）导向了废物终端，去除纯度达到了99.0 ± 0.5%。此外，第二阶段末端微粒的稳定聚焦行为和连续分离过程也得到了直观验证。10微米和5微米微粒的具体轨迹分别被记录下来。总之，这种级联微流控芯片采用了精确的被动流动阻力匹配技术，并结合了两种加宽的通道几何结构。该配置成功实现了三种不同微粒群体的连续分离和收集。整个装置仅由一个泵驱动，无需外部鞘液补偿，充分证明了该系统处理含有各种尺寸颗粒的复杂样品的强大能力。

**4. 结论**
本研究成功开发了一种基于被动流动阻力匹配的级联双螺旋微流控芯片。该架构能够实现多组分颗粒（特别是15微米、10微米和5微米目标颗粒）的连续且高纯度的分选。此外，该系统完全摒弃了传统多级微流控分选对外部鞘液补偿和多个独立泵阀设置的依赖，仅依靠一个微注射泵即可处理复杂的多组分流体样品，硬件配置极为简化。实验结果证实了自适应减速机制的必要性：高效提取大尺寸15微米目标颗粒需要较高的入口流速（1.6 mL/min），而彻底分离10微米和5微米颗粒则需要将流速降低到0.8–0.95 mL/min的范围。芯片通过预设非对称分叉流动阻力网络，使进入第二阶段主通道的等效流速降至0.91 mL/min，有效弥合了不同尺寸颗粒的最佳分离条件之间的流速差距。其次，在阶段间连接处和第二阶段末端设计的几何加宽结构显著增加了颗粒间的侧向分离距离，大幅降低了交叉污染的风险。

在 sorting 性能评估中，该系统处理了一个初始目标浓度比极低的复杂混合样品（约4.7%），在第一阶段分离口 successfully 维持了15微米颗粒92%的高回收率，使目标浓度提高了两倍以上，展现了出色的稀有微粒分选和纯化能力。在第二阶段分离过程中，系统实现了极高的分离纯度：10微米目标纯度达到98%，5微米杂质去除率超过99%。这种纯被动流动导向架构具有稳定的运行和高处理通量，为复杂混合系统的精确分类提供了坚实的流体动力学基础。

尽管所提出的级联双螺旋芯片在15微米、10微米和5微米混合物的分选方面表现出色，但仍存在一些局限性。将这种几何结构应用于其他尺寸组合时，需要按比例调整通道截面以保持必要的阻塞比（a/Dh > 0.07）和动态力平衡。此外，极端浓度比（如1:100:100）会导致颗粒严重拥挤，干扰聚焦流线，因此需要预先稀释样品以确保收集纯度。超过最佳流速会破坏力平衡，使 Dean 阻力超过惯性升力，从而导致分离分辨率下降，并可能在高操作压力下引发 PDMS 变形和液体泄漏。此外，实际生物样品具有内在复杂性，例如循环肿瘤细胞的尺寸分布广泛且具有细胞可变形性，这可能导致聚焦带变宽并偏离原始平衡位置，从而降低分选效果。为应对这些挑战，在实验准备阶段防止样品粘附和通道堵塞至关重要，可能需要重新校准最佳流速以提高分选效率。未来的工作将致力于探索尺寸可扩展的模型，并集成智能反馈机制，以适应更广泛的颗粒尺寸和高度复杂的临床样品。

这种级联芯片是一种极具前景的微流控预处理前端模块，具有广泛的应用前景，适用于未来高度集成的微系统。高纯度和连续输出的微粒流可以无缝连接到下游的微纳传感平台，实现从复杂样品的物理纯化到最终检测的完整链分析，且在极小的空间内完成。因此，这项技术有望显著提升微系统和纳米工程的临床及工业转化价值。特别是在复杂微粒的高通量筛选和生化即时检测等领域，该技术将发挥重要作用。

**补充材料**
以下支持信息可在以下链接下载：
https://www.mdpi.com/article/10.3390/mi17040469/s1:
视频 S1：第一阶段分叉处15微米微粒的轨迹；
视频 S2：第二阶段末端10微米微粒的轨迹；
视频 S3：第二阶段末端5微米微粒的轨迹。