NSUN2介导的RNA m5C失调将HBV感染与TFEB基因沉默及溶酶体功能障碍联系起来

《Antiviral Research》：NSUN2-mediated RNA m5C Dysregulation Links HBV Infection to TFEB Silencing and Lysosomal Impairment

HBV通过HBx蛋白抑制NSUN2表达，减少TFEB mRNA的m?C甲基化修饰，导致TFEB蛋白表达下降和溶酶体功能受损，揭示病毒逃避免疫的新表观遗传机制。

　　

Xuejiao Dong|Shuang Ding|Lili He|Fuyu Luo|Zhangbo Cui|Shi Tang|Guanli Zhan|Haojie Hao|Wuxiang Guan|Chunwei Shi

华中科技大学同济医学院基础医学院病原生物学系，武汉，中华人民共和国

摘要

背景

TFEB作为溶酶体活性的主要转录调节因子，在宿主抗病毒防御中起着核心作用。多种病毒会针对TFEB来逃避在宿主细胞中的溶酶体降解。本研究探讨了HBV如何通过NSUN2介导的m⁵C RNA修饰来抑制TFEB。

方法

使用pCH9-3091质粒（包含1.1倍HBV基因组）转染Huh7和HepG2细胞，或者转染HBx或HBx缺失质粒。HepG2-NTCP细胞被HBV感染。通过实时PCR或Southern印迹检测HBV的复制情况。使用Western印迹和实时PCR检测TFEB蛋白和mRNA的水平。使用蛋白酶体抑制剂MG-132来评估TFEB的降解情况。TFEB mRNA的m⁵C修饰通过GSE246879数据集和m⁵C-RIP-qPCR进行分析。在NSUN2过表达、敲低或酶缺乏的情况下，通过甲醛交联-RIP和m⁵C-RIP-qPCR验证NSUN2与TFEB mRNA的结合以及TFEB mRNA的m⁵C修饰。通过RNA稳定性和核糖体装载实验评估TFEB mRNA的稳定性和翻译效率。通过检测CTSD和LysoTracker-RED染色来评估TFEB介导的溶酶体降解。通过免疫组化检测注射HBx缺失突变体的小鼠肝脏组织中的NSUN2表达。

结果

HBV通过HBx蛋白下调m⁵C甲基转移酶NSUN2的表达，减少了TFEB mRNA的m⁵C修饰，这独立于蛋白酶体降解作用，损害了TFEB mRNA的稳定性和表达。NSUN2在TFEB mRNA上添加m⁵C标记以增强其稳定性并维持溶酶体活性。NSUN2的恢复能够重新建立TFEB mRNA的m⁵C修饰和稳定性，以及溶酶体功能。

结论

HBx-NSUN2-m⁵C-TFEB轴调控机制揭示了HBV免疫逃逸的表观转录组机制，为HBV感染治疗提供了潜在靶点。

引言

溶酶体是进化上保守的细胞器，富含水解酶^[1]，在宿主抗病毒免疫中起着核心作用，并在病毒感染期间发挥依赖上下文的功能^{2, 3}。通过介导内吞溶酶体和自噬过程，溶酶体降解内化的病毒颗粒及其成分，从而限制病原体的传播^[4]。这种抗病毒降解进一步由溶酶体蛋白酶（如组织蛋白酶）精细调节，这些蛋白酶通过抗原处理和呈递促进病毒清除或适应性免疫^[5]。许多病毒进化出了复杂的策略来劫持溶酶体功能，从而在宿主细胞中实现复制和持续存在^{6, 7, 8}。

转录因子EB（TFEB）属于基本螺旋-环-螺旋亮氨酸拉链（bHLH-LZ）家族，是溶酶体活性和降解的主要转录调节因子^{9, 10, 11}。TFEB包含一个用于DNA结合的转激活结构域（TAD）和一个含有核定位信号（NLS）序列的bHLH/LZ结构域^[12]。在核内转运后，TFEB的TAD直接结合目标基因启动子中的CLEAR基序（GTCACGTGAC）^{13, 14}。该基序在许多与溶酶体相关的基因中高度富集，包括CTSD（组织蛋白酶D）、CTSB（组织蛋白酶B）、LAMP1（溶酶体相关膜蛋白1）、LC3（微管相关蛋白轻链3）、ATG9B（自噬相关9B）、UVRAG（紫外线辐射抗性相关基因）和VPS18（液泡蛋白分选18）^[15]。因此，TFEB是溶酶体抗病毒功能的关键调节因子^[16]。越来越多的证据表明，多种病毒会针对TFEB来破坏溶酶体功能并促进病毒复制^{17, 18, 19}。

乙型肝炎病毒（HBV）感染对人类健康仍构成严重威胁。作为一种包膜双链DNA病毒，属于Hepadnaviridae家族^[20]，HBV在全球范围内慢性感染约3亿人，每年导致超过80万人死于肝硬化和肝细胞癌^[21]。尽管其基因组仅有3.2 kb，编码四个开放阅读框（S、C、P、X），HBV仍利用复杂的生物合成过程（包括形成共价闭合的环状DNA（cccDNA）小染色体、前基因组RNA（pgRNA）的转录以及pgRNA的逆转录）来建立持续感染²²。HBV的复制严重依赖于宿主细胞机制，协调的溶酶体降解已被证明可以在病毒进入和复制后期有效抑制HBV^{23, 24}。先前的研究表明，HBx蛋白通过抑制TFEB表达来抑制溶酶体降解^{25, 26}。然而，HBx介导的TFEB抑制的分子机制尚不清楚。

RNA甲基化修饰最近被证实是病毒致病性的关键调节因子，其中NSUN2介导的m⁵C（5-甲基胞嘧啶）mRNA甲基化在抗病毒免疫中起着关键作用^{27, 28}。作为最常见的RNA修饰之一，m⁵C涉及多种RNA物种中胞嘧啶残基第五位的甲基化^[29]。哺乳动物的m⁵C甲基转移酶包括NSUN蛋白家族（NSUN1–NSUN7）和DNA甲基转移酶同源物DNMT2^[30]。NSUN2是主要催化mRNA m⁵C修饰的酶，其活性依赖于两个保守的半胱氨酸残基（C271和C321）^{31, 32}。m⁵C修饰广泛调节mRNA的代谢，包括核输出、核糖体组装、翻译和稳定性^{33, 34, 35}。我们的最新研究发现，NSUN2通过m⁵C修饰IFN mRNA来正向调节肝细胞中的I型干扰素（IFN）表达^[36]。重要的是，HBV感染会下调NSUN2的表达，减少IFN相关基因的m⁵C标记，从而削弱先天免疫反应^[36]。

目前，关于RNA修饰和溶酶体如何调节HBV复制的研究仍然有限。在本研究中，我们阐明了NSUN2介导的m⁵C修饰在TFEB调控的溶酶体活性及其抗HBV效应中的作用。我们的发现表明，NSUN2催化的TFEB mRNA的m⁵C修饰对于维持肝细胞中的溶酶体功能和抗病毒效应至关重要。此外，HBV利用HBx下调NSUN2的表达，从而降低TFEB mRNA的m⁵C水平并沉默TFEB的表达，这是一种新的表观转录组逃逸策略。

部分摘录

转染pHBV1.1的Huh7细胞中TFEB mRNA的m⁵C修饰和TFEB的表达均减少

我们的最新研究表明，HBV通过其HBx蛋白下调NSUN2的表达，进而减少了干扰素（IFN）相关基因的m⁵C修饰^[36]。因此，我们推测HBV通过抑制NSUN2的表达来调节宿主抗病毒基因的表达，从而促进其在肝细胞中的合成。基于这一推测，我们对m⁵C修饰减少的差异基因进行了KEGG通路富集分析（图1A）

讨论

据报道，乙型肝炎病毒（HBV）会抑制溶酶体转录调节因子EB（TFEB）的转录，以促进病毒复制^[26]，但其背后的分子机制尚不清楚。本研究的发现表明，NSUN2对TFEB mRNA的m⁵C修饰对于维持肝细胞中的溶酶体活性和抗HBV防御至关重要，而HBV则利用其病毒蛋白HBx来下调m⁵C甲基转移酶NSUN2的表达，从而降低TFEB

材料与方法

材料与方法的相关内容见补充材料。

CRediT作者贡献声明

Zhangbo Cui： 方法学。Shi Tang： 方法学。Fuyu Luo： 研究、方法学。Shuang Ding： 研究、数据管理、概念化。Lili He： 方法学。Xuejiao Dong： 方法学、数据分析、数据管理。Chunwei Shi： 撰写 – 审稿与编辑、撰写 – 初稿、监督、资源管理、项目管理、方法学、研究、数据分析、概念化。Haojie Hao： 撰写 – 审稿与编辑、监督、数据分析。

利益冲突

无需要报告的利益冲突。

利益声明

所有作者均已阅读并批准了论文提交。不存在需要声明的利益冲突。

致谢

pCH9和pCH9-3091质粒由重庆医科大学的Lin Yong教授提供（中国重庆）。本研究得到了湖北省重点研发计划 [2021BCD004]的支持。