设计、合成和评估68Ga标记的基于肽的LGR5靶向放射性示踪剂，用于肿瘤成像

《Bioorganic Chemistry》：Design, synthesis, and evaluation of 68Ga-Labeled peptide-based LGR5-targeting radiotracers for tumor imaging

本研究通过计算模拟优化设计LGR5靶向肽P01和P02，并合成相应的68Ga标记PET示踪剂。结果显示P02具有更高亲和力（KD=74.11±24.52nM）和特异性，在LGR5阳性A549移植瘤中显像效率显著优于阴性NCI-H1299模型（肿瘤/肌肉比值达4.07±0.07）。实验验证了68Ga-LTP-02作为新型LGR5靶向PET探针的有效性。

　　

唐瑞|刘青竹|杨继晨|孙淼|秦佳文|彭颖|江慧杰|邱玲|林建国

国家卫生健康委员会核医学重点实验室，江苏省分子核医学重点实验室，江苏省核医学研究所，无锡214063，中国

摘要

富含亮氨酸重复序列的G蛋白偶联受体5（LGR5）在肿瘤的发生、进展、转移和治疗耐药性中起着关键作用，因此成为肿瘤诊断和治疗的有希望的生物标志物。在这项研究中，我们利用计算模拟设计了针对LGR5的肽P01和P02，并进一步开发了两种正电子发射断层扫描（PET）放射性示踪剂[⁶⁸Ga]Ga-LTP-01和[⁶⁸Ga]Ga-LTP-02，以准确检测LGR5的表达。这两种放射性示踪剂具有高放射化学纯度（RCP）和高产率（RCY），表现出良好的稳定性和有利的药代动力学特性。饱和结合实验表明[⁶⁸Ga]Ga-LTP-02对LGR5的结合亲和力（K_d = 74.11 ± 24.52 nM）高于[⁶⁸Ga]Ga-LTP-01（K_d = 153.40 ± 17.14 nM）。动态PET成像显示，在LGR5阳性的A549异种移植瘤中[⁶⁸Ga]Ga-LTP-02的摄取量明显高于LGR5阴性的NCI-H1299异种移植瘤（分别为4.74 ± 0.44 %ID/mL和0.98 ± 0.08 %ID/mL）。相应地，A549异种移植瘤模型中的肿瘤与肌肉比率（4.07 ± 0.07）也显著高于NCI-H1299模型（0.77 ± 0.10）。此外，生物分布研究进一步证实[⁶⁸Ga]Ga-LTP-02能够特异性地靶向LGR5阳性肿瘤。总之，本研究合成了两种基于LGR5的肽类PET放射性示踪剂并进行了临床前评估，其中[⁶⁸Ga]Ga-LTP-02在检测LGR5表达方面表现出更高的敏感性和特异性，并能有效地定位LGR5阳性肿瘤。

引言

富含亮氨酸重复序列的G蛋白偶联受体5（LGR5），也称为G蛋白偶联受体49或67（GPR49或GPR67），已被确定为肠道干细胞的标志物[1]、[2]、[3]。LGR5在多种人类恶性肿瘤中过度表达，包括结直肠癌[3]、肺癌[4]、胃癌[5]和乳腺癌[6]。这种上调通过激活Wnt/β-连环蛋白信号通路[7]、[8]，促进细胞增殖、迁移、侵袭、转移和血管生成等关键致癌过程，从而推动肿瘤进展。鉴于其在肿瘤中的特异性过表达及其在肿瘤进展中的关键作用，LGR5成为肿瘤靶向诊断和治疗的有希望的生物标志物。目前，越来越多的针对LGR5的治疗策略正在开发中，包括抗体-药物偶联物（ADCs）、肽-药物偶联物（PDCs）、CAR-T细胞疗法和双特异性抗体[9]、[10]、[11]、[12]。其中，CAR-T细胞疗法在结直肠癌治疗中显示出显著的抗肿瘤活性，目前正在进行临床试验[13]。此外，针对LGR5和表皮生长因子受体（EGFR）的双特异性抗体Petosemtamab正在进行I/II期临床试验，以评估其治疗复发性或转移性头颈部鳞状细胞癌的疗效[14]。鉴于LGR5靶向疗法在临床实践中的进展，开发一种非侵入性、实时和定量检测LGR5表达的工具至关重要。

正电子发射断层扫描（PET）具有高灵敏度、深层组织穿透能力和非侵入性，使其成为改善各种癌症临床结果的有希望的策略[15]、[16]。目前，仅有两种基于单克隆抗体的LGR5靶向PET放射性示踪剂[⁸⁹Zr-DFO-8F2和⁸⁹Zr-DFO-9G5]被报道[17]。它们可以提供敏感、实时和准确的体内监测结直肠癌（DLD-1）异种移植小鼠模型中LGR5的表达。然而，由于这些单克隆抗体放射性示踪剂分子量较大且组织渗透性差，其药代动力学特性不佳，需要数天时间才能从循环系统中清除并达到足够的对比度[18]、[19]、[20]。这不仅延迟了成像过程，还妨碍了及时评估肿瘤中的LGR5表达。相比之下，基于肽的放射性示踪剂在分子成像方面具有明显优势，包括低分子量、更好的组织穿透性、快速血液清除、低固有免疫原性以及简单的化学合成和修饰[21]、[22]。因此，需要一种具有高亲和力和特异性的放射性示踪剂来非侵入性地检测LGR5阳性肿瘤，从而提高治疗的精确度和有效性。

在最近的一项研究中，Kwak和Yun等人使用噬菌体展示平台鉴定了三种针对LGR5的肽：IPQ（序列：IPQILSI）[23]、YLA（序列：CYLASRVHC）[24]和STC（序列：STCTRSR）[25]。其中，标记有TAMRA的YLA肽在胃癌（MKN-45）异种移植小鼠模型中表现出高效的肿瘤靶向能力和较长的滞留时间。然而，YLA肽仍存在一些局限性，如亲水性不足和对LGR5的结合亲和力较低[24]。为了改进活性更高的LGR5靶向肽，我们采用了一种综合方法，结合分子对接和丙氨酸扫描突变进行肽优化，获得了两种线性肽P01（序列：YLASRVH）和P02（序列：YAASRVH）。这两种肽均与NOTA结合，随后进行镓-68放射性标记，生成了两种PET放射性示踪剂[⁶⁸Ga]Ga-LTP-01和[⁶⁸Ga]Ga-LTP-02。通过体外结合亲和实验、细胞摄取实验和体内PET成像评估了这两种放射性示踪剂对LGR5的结合亲和力和特异性。这项研究旨在实现LGR5表达的非侵入性成像，从而有助于开发LGR5过表达肿瘤的诊断方案。

部分摘录

LGR5靶向肽的设计与优化

利用LGR5与R-spondin-2复合物中的外域晶体结构（PDB ID：4UFR）进行了计算机模拟研究[26]。使用Autodock Vina进行分子对接，预测肽与LGR5之间的结合模式和相互作用，并通过丙氨酸扫描研究评估每个氨基酸残基对结合亲和力的贡献。进一步使用GROMACS进行分子动力学（MD）模拟，研究肽之间的相互作用

LGR5靶向肽的设计与合成

为了提高LGR5靶向肽的结合亲和力和亲水性，从而减少非特异性结合并加速其从血液中的清除，我们将环状肽YLA（序列：CYLASRVHC）线性化，生成其线性类似物P01（序列：YLASRVH）[28]。然后，使用分子对接评估这两种肽对LGR5的亲和力。肽P01和YLA与LGR5的相互作用及其结合亲和力数据在文中进行了详细说明

讨论

鉴于LGR5在癌症干细胞（CSCs）中经常过度表达，这一特性使其成为多种癌症类型中一个有希望的诊断和治疗靶点[1]、[29]。因此，敏感和特异性地检测LGR5表达对于早期诊断和LGR5阳性肿瘤的预后评估至关重要。PET成像技术的最新进展实现了体内实时、非侵入性的LGR5表达可视化与监测。基于抗体的

结论

在这项研究中，合理设计了两种基于肽的LGR5靶向放射性示踪剂[⁶⁸Ga]Ga-LTP-01和[⁶⁸Ga]Ga-LTP-02，并进行了生物学评估。这两种放射性示踪剂均表现出纳摩尔级的结合亲和力、良好的稳定性和药代动力学特性。细胞摄取实验和PET成像证实了这两种示踪剂检测LGR5表达的特异性和敏感性，体外组织分析进一步验证了这些结果。值得注意的是，[⁶⁸Ga]Ga-LTP-02

作者贡献

J.L.、L.Q.和H.J.构思并设计了研究方案。R.T.负责化学合成、放射性标记、体外和体内生物学实验以及相应的数据分析。Q.L.负责理论建模、细胞培养、动物模型构建及相应的数据分析。Y.P.、M.S.、J.Y.和J.Q.参与了化学合成和放射性标记。R.T.、H.J.、L.Q.和J.L.撰写并审阅了手稿。所有作者共同讨论了研究结果

CRediT作者贡献声明

唐瑞：撰写——原始草案、方法学、研究、正式分析。刘青竹：方法学、研究、正式分析。杨继晨：研究、正式分析。孙淼：研究。秦佳文：研究。彭颖：研究。江慧杰：撰写——审阅与编辑、监督、资金获取、概念化。邱玲：撰写——审阅与编辑、验证、监督、方法学、资金获取。林建国：撰写——审阅与编辑

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的可能会影响本文报道工作的竞争性财务利益或个人关系。

致谢

我们感谢国家自然科学基金（22076069和U23A20478）、江苏省基础研究计划（BK20241757和BK20241758）、江苏省卫生健康委员会的重大科研项目（ZD2022036）以及江苏省医学重点学科（实验室）（ZDXYS202211）的财政支持。