通过工程改造黑曲霉（Aspergillus niger）产生的β-甘露聚糖酶（β-mannanase），以简化并直接从瓜尔豆（guar）分离物中制备甘露寡糖（manno-oligosaccharides）的工艺

《Bioresource Technology》：Engineering pH and thermostability of β-mannanase from Aspergillus niger for simplified and direct production of manno-oligosaccharides from guar split

通过定向进化工程化改造A. niger来源的GH26家族β-半乳糖苷酶（mAnMan26），显著提升其在近中性pH（6.5）和45℃条件下的水解效率和稳定性。该酶在K. phaffii GS115中实现26000 U/mL的高表达水平，成功将10% w/v Guar split水解为分子量1475 Da的DP2-10 manno-oligosaccharides（占比87%），水解率达92.2%。体外发酵实验证实其益生元活性优于部分水解 Guar gum和果寡糖。本研究为 Guar split直接产高值寡糖提供高效生物催化剂策略。

　　

刘洪|姚琪|孙丹阳|吴晨轩|严桥娟|李艳晓|姜正强

中国农业大学食品科学与营养工程学院食品生物工程国家重点实验室，北京100083，中国

摘要

瓜尔胶裂解产物是一种有前景的可再生资源，可用于生产甘露寡糖。为了实现这种底物的直接高效水解，研究人员通过对黑曲霉产生的β-甘露聚糖酶进行定向进化改造，以提高其在接近中性条件下的性能。经过两轮筛选，获得了一种名为mAnMan26的突变体。该突变体在pH 6.5和45°C条件下表现出最佳活性，其催化效率和稳定性均显著优于野生型酶。研究发现三个氨基酸替换（Gln38Lys、Asp224Ala和Ala272Thr）共同促成了这些改进。该突变体在Komagataella phaffii GS115中得到了表达，表达水平达到26,000 U/mL。使用这种生物催化剂，10%（w/v）的瓜尔胶裂解产物在8小时内可水解产生73克甘露寡糖，转化率为92.2%。所得甘露寡糖的重量平均分子量为1475 Da，其中二糖单元（DP 2–10）占87%。体外发酵实验表明，该突变体具有优异的益生元活性，能比部分水解的瓜尔胶或果糖寡糖更有效地促进多种乳酸菌和双歧杆菌的生长。本研究提供了一种将瓜尔胶裂解产物直接高效转化为高价值甘露寡糖的新方法，为传统工艺提供了经济可行的替代方案。

引言

瓜尔胶（Cyamopsis tetragonoloba）是一种具有商业价值的豆科植物，主要在印度和巴基斯坦种植，全球产量中约90%来自这两个国家（Agricultural Statistics at a Glance, 2022）。从干重来看，其胚乳占种子的40%以上，并含有约50%的半乳甘露聚糖（Gautam等人，2024年）。这种多糖被提取用于生产瓜尔胶，这是一种广泛应用于食品、石油钻探、个人护理和制药等行业的多功能水胶体（Thombare等人，2016年）。瓜尔胶的一个高价值应用是其通过酶促转化生成甘露寡糖，后者具有多种生物活性，包括益生元效应、抗癌潜力和抗氧化活性（Jana等人，2021年；Jana和Kango，2020年）。然而，瓜尔胶强烈的凝胶形成能力导致溶液粘度极高，严重阻碍了酶促水解的效率，从而限制了甘露寡糖的产量（Mudgil等人，2014年）。因此，迫切需要寻找一种成本更低、更易于处理的替代底物以实现高效甘露寡糖的生产。

瓜尔胶裂解产物是从瓜尔胶胚乳中机械加工得到的产品，含有超过70%的半乳甘露聚糖，是生产瓜尔胶的主要原料（Gao和Grady，2018年）。与纯化的瓜尔胶相比，瓜尔胶裂解产物具有显著的成本优势，使其成为生产甘露寡糖的理想底物。然而，瓜尔胶裂解产物不溶于水，仅在水溶液中吸水后才会膨胀（Gao和Grady，2019年），这给直接酶促水解带来了挑战。目前文献中尚未报道从瓜尔胶裂解产物直接生产甘露寡糖的成熟方法。

β-甘露聚糖酶（EC 3.2.1.78）是一种在植物、动物和微生物中广泛存在的关键酶，能够催化甘露聚糖中的β-1,4-甘露糖苷键断裂，释放出不同聚合度（DP）的甘露寡糖（Kim等人，2025年；Lin等人，2025年）。但其水解效率很大程度上受底物结构的影响（Wang等人，2024a）。瓜尔半乳甘露聚糖是β-甘露聚糖酶的主要底物，其主链由β-1,4连接的甘露糖残基组成，同时含有α-1,6连接的半乳糖侧链，半乳糖与甘露糖的比例约为1:2（Thombare等人，2016年）。这些半乳糖侧链会形成空间障碍，阻碍许多β-甘露聚糖酶的催化作用，尤其是GH家族5成员对此类替换特别敏感（Malgas等人，2015年）。例如，来自Rhizomucor miehei CAU432的GH家族5 β-甘露聚糖酶（RmMan5A）水解瓜尔胶后仅产生部分水解的瓜尔胶（PHGG），其重量平均分子量为25000 Da（DP约为146）（Li等人，2017a）。相比之下，GH家族26 β-甘露聚糖酶（如来自Westerdykella属和Yunnania penicillata的酶）具有开放的催化槽，可以容纳半乳糖侧链，从而更有效地水解瓜尔半乳甘露聚糖（von Freiesleben等人，2019年）。与此结构优势相符，来自Bacillus sp. CFR1601的GH家族26 β-甘露聚糖酶（ManB-1601）水解瓜尔胶后产生的产品平均分子量为3814 Da（DP约为22）（Srivastava和Kapoor，2015年），虽然仍高于典型的甘露寡糖范围（DP ≤ 10）。因此，找到一种能够高效且广泛水解瓜尔半乳甘露聚糖的β-甘露聚糖酶至关重要。

尽管野生型β-甘露聚糖酶具有多样的催化特性，但许多酶缺乏工业应用所需的特异性活性、稳定性或表达水平（Chen等人，2025年；Tan等人，2023年）。为克服这些限制，人们采用了定向进化技术来提升β-甘露聚糖酶的性能。对R. miehei CAU432来源的β-甘露聚糖酶进行改造后，其在酸性和嗜热条件下的活性提高了3.0倍（Li等人，2017b）；而对Pantoea agglomerans A021来源的酶进行改造后，催化效率提高了1.1倍（Wang等人，2013年）。此外，实现高水平的表达对于经济高效地生产酶至关重要。Komagataella phaffii是重组表达β-甘露聚糖酶的优选宿主（Kaira和Kapoor，2021年）。然而，关于高表达水平的报道仍然有限，例如来自Bacillus sp. MK-2和Chaetomium sp. CQ31的酶（Katrolia等人，2012年；Liu等人，2020a）。因此，结合蛋白质工程和优化表达策略对于克服现有限制并充分发挥β-甘露聚糖酶的工业潜力至关重要。

在我们之前的研究中，来自黑曲霉的GH家族26 β-甘露聚糖酶（AnMan26，GenBank编号：XP_025449766.1）对多种植物胶中的半乳甘露聚糖表现出高效的水解能力（Wang等人，2021年）。然而，其活性仅在较窄的酸性pH范围内（4.0–6.0）最佳，在接近中性条件（pH 6.5–7.5）时活性降至最大值的20%以下。由于瓜尔胶或瓜尔胶裂解产物在水中的悬浮液呈弱酸性至中性，野生型酶不适合直接水解。为了解决这一问题，我们采用定向进化技术对AnMan26进行了改造，以提高其在接近中性条件下的性能。该突变体在K. phaffii中进行了高细胞密度发酵，并用于直接水解瓜尔胶裂解产物以生产甘露寡糖。随后通过体外发酵实验评估了所得甘露寡糖的益生元潜力。这项工作建立了一种新型、可持续且经济高效的方法，将瓜尔胶裂解产物转化为高价值甘露寡糖，为精炼瓜尔胶提供了实用的工业替代方案。

材料

质粒pPIC9K-AnMan26是根据先前建立的方案制备的（Wang等人，2021年）。载体pET28a(+)和pPIC9K分别从Novagen（威斯康星州麦迪逊）和Invitrogen（加利福尼亚州卡尔斯巴德）获得。大肠杆菌 BL21（DE3）和K. phaffii GS115被用作异源表达的宿主。槐豆胶（LBG，来自Ceratonia siliqua种子）从Sigma-Aldrich（密苏里州圣路易斯）购买。甘露糖（M2）、甘露三糖（M3）、甘露四糖（M4）和甘露五糖（M5）等试剂也用于实验。

突变体文库的筛选

通过易出错的PCR和DNA重组技术构建了一个包含约10,000个克隆的突变体文库（图1A）。在第一轮筛选中，约15%的克隆在LBG平板上形成了可见的水解晕圈（图1B）。其中约600个克隆产生的水解晕圈直径与野生型对照相当或更大。这些候选克隆被进一步筛选，以确定其最佳pH值和温度。

结论

通过对黑曲霉来源的GH家族26 β-甘露聚糖酶进行定向进化，获得了一种突变体（mAnMan26），其在接近中性条件下的活性和稳定性显著提高，同时保持了其他催化特性。该突变体在K. phaffii GS115中的表达水平达到26,000 U/mL，显示出巨大的工业生产潜力。当用于直接水解瓜尔胶裂解产物时，mAnMan26能够高效地产生甘露寡糖（DP 2–10）。

CRediT作者贡献声明

刘洪：撰写初稿、软件开发、方法设计、实验研究。姚琪：软件开发、方法设计。孙丹阳：软件开发、方法设计。吴晨轩：资源准备。严桥娟：监督工作、资源协调、资金争取、数据管理、概念构思。姜正强：监督工作、资源协调、概念构思。

利益冲突声明

作者声明没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文的研究结果。

致谢

本工作得到了国家自然科学基金（项目编号：22378419）、国家乳品技术创新中心（项目编号：2024-QNJJ-013）以及中国农业大学的2115人才发展计划的支持。