通过基因组解析揭示DNRA微生物在粪便堆肥过程中产生N2O（氧化亚氮）中的重要作用

《Bioresource Technology》：Genome-Resolved insights into significance of DNRA Microbes in N2O production during manure composting

硝氧化物减排与堆肥工艺优化研究。通过多组学技术揭示堆肥中异养反硝化（HD）和溶解性硝酸盐还原到铵（DNRA）协同贡献N?O生成机制，发现病毒通过溶原性循环调控DNRA基因表达，高温和低氧条件显著增强DNRA活性，且35.2%的微生物同时携带HD和DNRA基因。该成果为精准调控堆肥过程N?O排放提供理论依据。

　　

杨慧静|彭能龙|范一军|黄静|张俊茂|李莉|丁继娟|唐志强|宋珏|刘定发|胡瑞文|何志立|王成

环境科学与工程学院，南方海洋科学与工程广东实验室（珠海），中山大学生物控制国家重点实验室，广州510006，中国

摘要

在粪便堆肥过程中，一氧化二氮（N₂O）的产生传统上主要归因于异养反硝化作用（HD），而其他途径的作用尚未得到充分研究。通过分析来自不同粪便来源的37个样本的时间分辨多组学数据，本研究探讨了堆肥过程中产生N₂O的途径的转录图谱。与反硝化作用相关的微生物，包括Fermentimonas和JAHWKS01谱系，占N₂O产生基因表达的21.2–33.1%——与HD相当——表明DNRA是一个之前被低估的来源。DNRA相关的基因表达受到病毒因素的调控，主要是通过溶菌性Caudoviricetes噬菌体。将分析范围扩展到174个公共宏基因组数据集后，发现DNRA产生的N₂O基因丰度在静态和超嗜热条件下达到峰值，这突显了通风和温度作为关键的控制因素。此外，本研究还发现了一部分同时具备DNRA和HD途径的微生物。这些发现有助于更深入地理解堆肥过程中N₂O的排放机制，并为多途径减排策略提供依据。

引言

堆肥是可持续废物管理的基石，能够有效地将有机废物转化为有价值的农田肥料（Bernal等人，2009年）。然而，这一过程同时也是温室气体的重要来源，尤其是来自富含氮的基质（如粪便）的一氧化二氮（N₂O）。这些N₂O排放占堆肥过程100年全球变暖潜能（GWP100）的50–90%（Nordahl等人，2023年），对全球变暖和平流层臭氧层破坏都有显著影响。虽然N₂O的产生既可以通过生物途径也可以通过非生物途径实现，但在堆肥系统中微生物转化占主导地位（Qin等人，2023年；Wang等人，2023年）。因此，阐明粪便堆肥过程中N₂O产生的微生物决定因素对于制定有效的减排策略至关重要，同时保持这一重要回收过程的农业效益。

堆肥环境的特点是水分含量高且气体扩散受限（Bernal等人，2009年），这形成了空间上不同的好氧和厌氧微生物环境。这些区域支持多种N₂O产生途径，包括硝化作用（NN）、硝化菌反硝化作用（ND）和不完全异养反硝化作用（HD）（Nordahl等人，2023年；Sánchez等人，2015年）。尽管HD被认为是堆肥过程中N₂O排放的主要来源（Sánchez等人，2015年；Xu等人，2024年），但其他重要途径（如真菌反硝化作用（FD）和反硝化作用产生的铵（DNRA）仍缺乏充分研究。值得注意的是，DNRA是一种普遍存在的硝酸盐还原过程（Strohm Tobin等人，2007年），其产生的N₂O是一氧化氮解毒的副产品（Sun等人，2016年），在堆肥环境中的基因丰度与HD相当（Xu等人，2024年），但其对N₂O排放的重要性经常被忽视或认为可以忽略。这种知识空白源于对N₂O产生途径及其相关微生物群落的不完全了解（Qin等人，2023年）。多组学方法，特别是宏基因组学和宏转录组学的发展，现在使得能够全面分析产生N₂O的基因丰度和表达模式（Wang等人，2023年）。特别是，通过组装宏基因组（MAGs）可以提供关于N₂O形成途径及其代谢背景的前所未有的见解（Xu等人，2024年）。然而，将这些强大工具综合应用于阐明堆肥系统中的N₂O形成机制的研究仍然较少。

N₂O的排放在整个堆肥过程中表现出明显的时间模式，这些模式受到基质组成和不断变化的物理化学条件的强烈影响。堆肥过程通常包括连续的加热和冷却阶段，每个阶段都有独特的排放特征。在加热阶段，易分解有机物的快速矿化使温度升高超过40°C（Bernal等人，2009年），暂时抑制了微生物活动和N₂O的产生。随后的冷却阶段，随着基质稳定和温度下降，微生物活动重新活跃，N₂O排放达到峰值（Li等人，2024年）。虽然N₂O的产生主要受电子供体和受体（主要是有机碳和含氮化合物）的影响，但排放与碳氮比（C/N）之间的关系仍存在争议（Bahram等人，2022年），尽管已证实硝酸盐浓度升高与N₂O产生增加之间存在相关性（Liu等人，2023年）。关键的是，堆肥过程中动态物理化学性质与特定N₂O产生途径之间的机制联系尚未得到充分阐明。

鉴于有证据表明DNRA驱动N₂O的产生，并且认识到堆肥环境有利于DNRA的发生，本研究旨在通过阐明N₂O产生的微生物动态和机制基础，来澄清这一之前被忽视的途径在堆肥相关N₂O排放中的重要性。我们假设DNRA在各种堆肥条件下都是一个重要的但被低估的N₂O产生途径。为了验证这一假设，我们使用一系列物理化学分析和多组学方法，对四个试点规模的畜禽粪便堆肥系统进行了时间分辨监测。通过关注与DNRA相关的微生物谱系及其在N₂O产生中的功能作用，本研究提供了关于粪便堆肥过程中N₂O排放微生物来源的新机制见解，从而为制定更具气候适应性的废物管理策略提供了依据。

部分摘录

粪便堆肥系统和采样设计

我们在中国杭州建立了一个2公吨的典型试点规模猪粪便风行堆肥系统，进行了82天的监测。初始水分含量调整至65%（w/w），之后无需进一步干预。通过被动通风和定期翻动来实现通气。在第3天、22天、48天和61天，从六个空间分布的位置采集子样本并混合得到复合样本

粪便堆肥过程中N₂O排放与基因表达模式的时间相关性

我们观察到试点规模粪便堆肥过程中N₂O排放的明显时间特征：在加热阶段有轻微增加，随后在冷却阶段显著增加（图1a）。为了阐明这一现象的分子基础，我们应用宏转录组学方法量化了关键N₂O产生基因（包括norB和CYP55）的表达谱型和分类归属（图1b）。

结论

本研究表明，DNRA占N₂O产生基因表达的很大比例，表明DNRA在N₂O产生中的作用之前被低估了。我们的研究还发现，同时具备DNRA和HD能力的微生物广泛存在，这可能解释了为什么DNRA之前被忽视。此外，我们发现静态和超嗜热堆肥条件显著增强了N₂O产生基因的表达

CRediT作者贡献声明

杨慧静：撰写 – 审稿与编辑，撰写 – 原稿，可视化，验证，软件，资源，方法学，研究，正式分析，数据管理，概念化。彭能龙：撰写 – 审稿与编辑，软件，资源，方法学，数据管理，概念化。范一军：验证，监督，软件，资源，方法学，概念化。黄静：撰写 – 审稿与编辑，验证，监督，软件，项目管理。

利益冲突声明

作者声明他们没有可能影响本文工作的财务利益或个人关系。

致谢

本研究得到了广东省农业和农村振兴高层次人才专项支持计划（NYQN2025001）、国家自然科学基金（32570115、32370113、52070196）、南方海洋科学与工程广东实验室（SML2024SP022、SML2024SP002、312024005）、广东省基础与应用基础研究基金（2024A1515010931）以及海洋负碳排放（ONCE）计划的支持。