nirB和nirD基因对于假单胞菌Pseudomonas putida Y-9在有氧条件下进行同化作用和异化作用下的亚硝酸盐还原过程都是必不可少的

《Bioresource Technology》：The nirB and nirD genes are essential for both assimilatory and dissimilatory reduction of nitrite in Pseudomonas putida Y-9 under aerobic conditions

硝酸盐还原酶NirBD基因在好氧条件下同时介导厌氧氨氧化（ANRA）和反硝化作用（DNRA），基因敲除导致亚硝酸盐积累、硝酸盐去除效率下降及生长抑制，且氮代谢相关基因表达变化证实其独立功能。

　　

罗罗|罗宇文|黄学娇|李振伦

中国广西大学农学院农业环境与农产品安全重点实验室，南宁530004

摘要

NADH依赖性亚硝酸盐还原酶NirBD已知可将亚硝酸盐（NO₂^–）还原为铵（NH₄⁺），但编码基因和是独立发挥作用还是协同作用，以及它们是否影响其他氮转化过程，目前仍不清楚。本研究系统地探讨了和在Pseudomonas putida Y-9中的氮代谢中的各自作用。删除或会严重抑制NO₂^–的还原。在含有50 mg/L硝酸盐（NO₃^–）的培养基中培养4天后，突变体的NO₃^–去除效率分别仅为野生型菌株的77%和61%（野生型为87%），同时伴随着大量亚硝酸盐的积累（分别为35.69 mg/L和28.38 mg/L，而野生型中未检测到亚硝酸盐），并且生长受到显著抑制。尽管删除一个基因会强烈上调另一个基因的表达（11.21至17.10倍），并提高硝酸盐还原酶napA和narG的表达，但这种转录响应不足以恢复NO₂^–的还原。¹⁵N同位素追踪直接证明了在好氧条件下，nirB和< />既参与同化性硝酸盐还原（ANRA），也参与异化性硝酸盐还原为铵（DNRA）。在NH₄⁺培养基中，突变体的生长与野生型相当，但总氮去除量减少，同时glnA的表达上调（3.39至2.00倍）。综合这些发现表明，和对P. putida Y-9中的ANRA和DNRA途径都是必需的，并且影响NH₄⁺的吸收。本研究扩展了目前对好氧DNRA的理解，为土壤和废水处理系统中的氮管理提供了分子和生理学基础。

引言

氮是陆地和水生生态系统中的关键限制性营养素，其命运在很大程度上受微生物转化的调控。反硝化和厌氧铵氧化通过将活性氮转化为气态形式（N₂O和N₂）导致氮的损失（Yang等人，2017年；Kuypers等人，2018年）。相比之下，异化性硝酸盐还原为铵（DNRA）将硝酸盐（NO₃^–）还原为铵（NH₄⁺以维持氧化还原平衡，生成的NH₄⁺释放到环境中；而同化性硝酸盐还原为铵（ANRA）则将NO₃^–还原为NH₄⁺直接用于生物量合成（Cheng等人，2022年；Cai等人，2023年；Wan等人，2023年）。尽管这两种途径的生理作用不同，但最终都产生NH₄⁺，这是一种稳定且可被生物利用的氮形式（Heo等人，2020年；Besson等人，2022年）。因此，深入理解这些途径的分子机制对于开发增强自然和工程系统中氮保留的策略至关重要。

在酶学层面，ANRA和DNRA都涉及硝酸盐还原酶（Nar或Nap）将NO₃^–依次还原为亚硝酸盐（NO₂^–），随后将NO₂^–还原为NH₄⁺（Liu等人，2023b年；Zhou等人，2023年）。在ANRA中，NO₂^–还原为NH₄⁺完全由细胞质中的NADH依赖性亚硝酸盐还原酶NirBD介导；而在DNRA中，这一步骤可以由NirBD或胞周细胞色素亚硝酸盐还原酶NrfA催化（Wang等人，2019年；Xu等人，2021年）。nrfA传统上被用作DNRA的分子标志物，因为它在已知具有DNRA能力的细菌中广泛存在（Wang等人，2024年）。然而，最近的证据表明，仅含有的细菌也具有显著的DNRA活性（Anonymous等人，2023年；Heo等人，2020年；Luo等人，2023b年），这突显了在两种氮保留途径中的重要性。尽管如此，通常被视为一个单一的功能单元，但和是独立发挥作用还是协同作用，以及它们在ANRA和DNRA中是否各自都是必需的，目前仍不清楚。

除了和的个体作用尚未明确外，这些基因所处的环境条件也值得关注。传统上认为DNRA是一个严格厌氧过程（Woods，1938年；Liu等人，2023b年）。然而，越来越多的证据表明，在土壤环境中也存在好氧条件下的DNRA，例如Bacillus属和Pseudomonas属细菌可能是其参与者（Medinets等人，2015年；Minick等人，2016年；Pandey等人，2020年）。此外，在纯培养的Delftia sp. B7（Ouyang等人，2024年）、Bacillus cereus J1（Cao等人，2024年）和Arthrobacter sp. 24S4-2（Liu等人，2023b年）中也发现了好氧DNRA。这些发现扩展了DNRA的生态范围，表明它可能在富氧环境（如农业土壤和好氧废水处理系统）中对氮保留有重要作用。尽管取得了这些进展，但好氧DNRA的分子机制仍不完全清楚。

Pseudomonas putida Y-9是从水稻田土壤中分离出的耐寒菌株，在15°C下仍能高效进行氮转化（Xu等人，2017年）。该菌株在好氧条件下同时具有DNRA和ANRA活性，且基因已被证实对这两种过程都是必需的（Anonymous，2020年；Anonymous，2022年）。然而，和在ANRA和DNRA中的具体作用，以及它们是否还参与除NO₂^–还原之外的其他氮转化过程，目前仍不清楚。为了解决这一知识空白，我们在P. putida Y-9中构建了和的单独缺失突变体及其互补菌株。通过结合氮转化分析、基因表达检测和¹⁵N同位素追踪，系统地研究了和在好氧ANRA和DNRA中的各自作用。我们的发现加深了对氮保留途径的机制理解，并为不同环境系统中的氮管理提供了启示。

细菌菌株和培养基

本研究使用了从中国贵州省长期积水稻田土壤中分离出的Pseudomonas putida Y-9（Xu等人，2017年）。其基因组序列数据及基因序列已分别存入NCBI，登录号为PRJNA1125840（BioProject）和MK561362.1（GenBank）。

用于细菌富集的Luria-Bertani（LB）培养基成分（每升）：10.00克色氨酸、5.00克酵母提取物和10.00克NaCl，pH值调整至7.0–7.2。

用于硝酸盐转化的培养基（NM）

nirB和突变体及其互补菌株的构建与验证

nirB和缺失突变体（ΔnirB和ΔnirD）是通过双同源重组构建的，并通过PCR进行了验证（图1A）。qPCR分析显示，ΔnirB中的表达降至野生型的0.0001倍（图2A），ΔnirD中的表达降至野生型的0.01倍（图2B）。低残留的转录本水平可能是由于框架内删除保留了部分基因序列，这些序列仍能被qPCR引物检测到。

结论

本研究提供了遗传和同位素证据，证明和在P. putida Y-9中单独存在且对NO₂^–的还原是必需的，且在好氧条件下同时参与ANRA和DNRA。此外，删除或会影响NH₄⁺的吸收，表明它们的影响超出了NO₂^–还原，涉及更广泛的氮代谢过程。虽然这项工作明确了和在基因水平上的作用，但其在生化和生理方面的作用仍需进一步研究。

CRediT作者贡献声明

罗罗：撰写初稿、数据可视化、实验设计、数据分析、数据管理。罗宇文：撰写初稿、结果验证、实验设计、数据管理。黄学娇：撰写与编辑、研究监督、方法学设计、资金获取、概念构思。李振伦：撰写与编辑、研究监督、资源提供。

利益冲突声明

作者声明没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文所述的工作。

致谢

本工作得到了国家自然科学基金（编号42107333）和广西青年精英科学家资助计划（编号GXYESS2025043）的支持。