“活体电子学”：将 S. oneidensis MtrC-SpyTag 细胞与经过 SpyCatcher 改性的电极耦合，实现直接电子转移
《Biosensors and Bioelectronics》：Living electronics: Coupling S. oneidensis MtrC-SpyTag cells to SpyCatcher-functionalized electrodes for direct electron transfer
编辑推荐：
1.本研究利用SpyTag-SpyCatcher技术将表面暴露的SpyTag整合到Shewanella oneidensis的外膜c型细胞色素MtrC中，通过转座子筛选确定W314、Y417、T603三个功能整合位点，验证了该系统可增强微生物与电极的导电结合，显著提高电荷转移效率并减少红ox穿梭洗脱问题。
卢卡斯·克诺尔（Lukas Kneuer）|雷内·沃斯特（René Wurst）|克里斯蒂安·乔纳斯·拉普（Christian Jonas Lapp）|阮光乐（Nhat Quang Le）|莉亚·科布扎（Leah Kobza）|米莱娜·门泽尔（Milena Menzel）|埃迪娜·马伦·克莱因（Edina Marlen Klein）|劳拉-阿丽娜·菲利普（Laura-Alina Philipp）|卡塔琳娜·M·帕克特（Catarina M. Paquete）|约翰内斯·格舍尔（Johannes Gescher）
德国汉堡工业大学技术微生物学研究所
摘要
本研究旨在利用SpyTag-SpyCatcher交联系统以及一种用于细胞外电子传输的模型生物——Shewanella oneidensis，建立一种易于应用的系统来改进各种生物电子设备。为此，表面展示的型细胞色素MtrC被配备了可访问的SpyTag，并与经过SpyCatcher功能化的表面耦合。通过转座子筛选和纳米孔测序，确定了能够促进MtrC功能性的整合位置，同时保持SpyTag在表面上的可访问性。最终选择了三个整合位置（W314、Y417、T603）进行进一步表征。在缺乏所有外膜细胞色素的S. oneidensis菌株中表达MtrC-SpyTag构建体后，恢复了其还原细胞外电子受体的能力。其中两个菌株的还原速率达到了野生型MtrC的水平，证明整合的SpyTag不会妨碍细胞外电子转移。在体内实验中，所有三个构建体与SpyCatcher功能化的磁珠的结合性能均显著优于野生型MtrC对照组。最具潜力的两个构建体被连接到导电的磁性金纳米颗粒上，并用于印刷电极的测试，展示了MtrC-SpyTag表达如何改善生物电子设备。在线性扫描伏安法和计时安培法实验中，电荷转移效率显著提高。此外，观察到电子转移方式的改变，减少了流动系统中氧化还原穿梭效应带来的问题。细胞直接与SpyCatcher功能化电极结合后，即使在彻底清洗电极后仍能产生稳定的电流。这种多功能的SpyCatcher工具箱可以与本文报道的菌株结合使用，以解决生物电子学中的瓶颈问题，如生物膜形成不良或产生绝缘的细胞外聚合物基质。
引言
电子工业和纳米技术的快速发展导致了对导电材料的需求增加，尤其是在柔性可穿戴设备和物联网创新方面（Rogers等人，2010年；Someya等人，2016年）。目前，大多数电子产品依赖于通常含有稀有或昂贵元素的刚性材料（Gao等人，2024年）。这些材料难以回收，并可能由于含有重金属或有害化学物质而带来健康风险（Kiddee等人，2013年）。因此，寻找既能保持高性能又能引入新特性的可持续替代品至关重要。此外，人们越来越关注将电子设备与生物实体结合，从而催生了生物电子学领域。其主要目标是将生物材料与电子设备连接起来，利用这些混合材料影响生物功能、检测生物传感器中的特定触发因素，或用生物有机成分替代电子设备中的无机成分（Rivnay等人，2017年）。
然而，将生物学与电子设备结合并不简单，因为生物系统内的通信往往无法直接与传统电子基础设施连接（Liu，2021年；Chenani等人，2024年）。外电子微生物是一个显著的例外，它们能够在缺氧条件下通过氧化有机或无机化合物来产生能量，并将这一过程与通常终止于细胞表面外膜蛋白的呼吸电子传递链相连。这些外膜蛋白是多血红素型细胞色素，其功能类似于导线，沿着三维结构传递电子（Reguera等人，2005年；White等人，2016年）。已对这些细胞色素的结构进行了广泛研究，从血红素中心到血红素中心的电子传递途径也基本明确（Paquete等人，2022年）。通过对这些外电子微生物的基因工程改造，开发出了生物传感器，将电子传递链中特定组分的启动子与不同分析物的传感器域连接起来（Golitsch等人，2013年；Webster等人，2014年；Si等人，2015年）。在外电子微生物模型生物中，Shewanella oneidensis和Geobacter sulfurreducens是研究最深入的两种。尽管S. oneidensis在生物电化学系统中的电流密度通常低于G. sulfurreducens，但其易于基因操作和兼性厌氧的生活方式使其成为生物电子应用中特别多用途的底盘，也是本研究的优选对象。
尽管取得了这些进展，但在生物学与电子设备之间建立有效接口仍面临挑战。微生物附着在无机电极上起着关键作用（Catania等人，2021年）。许多可持续导电材料由于其疏水性而存在局限性，限制了微生物的牢固和快速附着。初次附着后，微生物通常会生成主要由糖聚合物、DNA和蛋白质组成的细胞外聚合物物质（EPS）（Flemming和Wingender，2010年；Flemming等人，2023年）。虽然某些微生物可以通过蛋白质纳米线生成导电的细胞外基质，但这种能力并不普遍。因此，EPS的形成可能成为电子转移的绝缘层（Xiao等人，2017年）。为了推进生物学与电子学的接口，多项研究报道了使用聚合物将微生物与导电基质连接到电极上，从而提高电流输出（Zajdel等人，2018年；McCuskey等人，2020年；Knoll等人，2022年）。在这些研究中，聚合物不仅作为细胞与电子设备之间的连接器，还通过增加电极表面积来增强电极性能。例如，Zajdel等人（2018年）将S. oneidensis嵌入可打印的导电PEDOT:PSS基质中，使电流输出增加了20倍；Knoll等人（2022年）制备了由S. oneidensis和导电琼脂糖组成的合成水凝胶，喷涂在电极上后电流输出增加了9倍（1324 mA m?2）。同样，McCuskey等人（2020年）创建了S. oneidensis与聚电解质的复合材料，沉积在金电极上后电流输出增加了150倍。然而，一个尚未解决的重大挑战是如何在不使用上述聚合物的情况下，在生物细胞与稳定电极之间建立直接的导电接口。在本研究中，我们利用SpyTag/SpyCatcher技术和S. oneidensis的外膜细胞色素MtrC实现了这一目标。SpyTag/SpyCatcher技术基于Streptococcus pyogenes的CnaB2蛋白结构域，该结构域可以分成一个13个氨基酸长的多肽（SpyTag）和一个116个氨基酸长的多肽（SpyCatcher）。当这两种成分在各种条件下接触时，会自发形成异肽键（Zakeri等人，2012年）。
为此，我们开发了一种转座子筛选方法，将SpyTag多肽序列整合到基因的任意位置，并筛选出表达MtrC-SpyTag版本的S. oneidensis细胞，这些细胞保留了MtrC的功能性，并在表面暴露了SpyTag。我们选择了三个特别感兴趣的位置，因为它们位于MtrC结构内部且靠近血红素中心，评估了它们将细胞附着到电极上并形成先进直接细胞-电极接口的潜力。所有三个MtrC-SpyTag构建体都保持功能性，并在表面暴露了SpyTag，从而实现了细胞与人工表面的共价耦合。此外，我们证明这种交联系统可以用于将细胞与电极共价和导电地耦合，从而提高这些系统中的电荷转移效率。
实验部分
细胞培养
E. coli和S. oneidensis分别在有氧条件下（LB培养基，10 g L-1色氨酸，5 g L-1酵母提取物，5 g L-1 NaCl）和37 °C或30 °C下培养。
S. oneidensis在M4最小培养基（2.21 g L-1 K2HPO4，0.99 g L-1 KH2PO4，87.70 g L-1 NaHCO3，11.89 g L-1 (NH4)SO4）中培养，同时添加0.1 mM MgCl2，1 mM CaSO4，1 g L-1酪蛋白水解物和微量元素（2.50 g L-1 Na2EDTA • 2 H2O，21.30 mg L-1 MnSO4 • H2O，58.40 mg L-1 NaCl，107.40 mg L-1 FeCl2 • 4 H2O）。
结果
本研究旨在利用集成到MtrC中的SpyTag/SpyCatcher系统，将S. oneidensis共价和导电地连接到电极表面。然而，这一系统的成功实施取决于两个关键因素：首先，表面展示的SpyTag应位于暴露的位置，以便于SpyCatcher的耦合而不受空间阻碍；其次，SpyTag的整合不应破坏MtrC的结构，以保持其功能性。
讨论
在本研究中，我们建立了一种可以直接应用于生物电子学的细胞-电极连接方法。我们首先开发了一种克隆技术，可以在一周内将任何给定的DNA序列整合到目标基因的任意位置。为了研究交联剂在MtrC中的整合效果，我们进行了高通量检测，筛选出能够使细胞与电子设备结合的表面可访问交联剂，同时保持...
CRediT作者贡献声明
卢卡斯·克诺尔（Lukas Kneuer）：撰写——审稿与编辑，撰写——初稿，可视化，方法学，研究，数据分析，概念化。雷内·沃斯特（René Wurst）：撰写——审稿与编辑，研究。埃迪娜·马伦·克莱因（Edina Marlen Klein）：监督，研究。劳拉-阿丽娜·菲利普（Laura-Alina Philipp）：撰写——审稿与编辑，监督，概念化。卡塔琳娜·M·帕克特（Catarina M Paquete）：撰写——审稿与编辑，监督，概念化。约翰内斯·格舍尔（Johannes Gescher）：撰写——审稿与编辑，撰写——初稿，监督，
未引用参考文献
Kitayama等人，2017年；Lutz和Hermann，1997年；Myers和Nealson，1988年；Schuetz等人，2009年；White等人，2013年。
资助
本工作得到了德国研究基金会（优先项目SPP2240（项目编号445800740）和优先项目SPP2494（项目编号559358135）的支持。
致谢
我们衷心感谢德国研究基金会（优先项目SPP2494（项目编号559358135）和优先项目SPP2240（项目编号445800740）的资助。
我们还要感谢Nils Grünke在准备电化学测量基础设施方面提供的热情支持，以及Daniel Bauer在显微图像计数方面提供的宝贵帮助。
