《Chemico-Biological Interactions》：PINK1-PARKIN-Dependent Mitophagy Links Diphenyltin Exposure to Steroidogenic Collapse in Rat Leydig Cells During puberty
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DPT暴露通过氧化应激、线粒体分裂及自噬影响青春期大鼠Leydig细胞功能并抑制睾酮生成。摘要：二苯锡（DPT）作为环境污染物可破坏Leydig细胞线粒体动态平衡，引发氧化应激和自噬，导致睾酮分泌减少和精子生成障碍。
朱琪琪|于建勤|陈念慈|田莉莉|胡春楠|陈全旭|朱阳|葛仁山|刘毅|李兴旺
温州医科大学第二附属医院及玉英儿童医院麻醉与围手术医学科，教育部儿科麻醉学重点实验室，浙江省精准麻醉学重点实验室，中国浙江省温州市325027
摘要
二苯基锡（DPT）是一种有机锡化合物和内分泌干扰物，会损害男性生殖系统。然而，DPT对青春期莱迪希细胞（Leydig细胞）功能的影响尚不清楚。DPT具有选择性的睾丸毒性，但不会改变生殖器官的总体重量。在出生后第35天至第57天期间，给大鼠施用2.5-10 mg/kg的DPT时，5 mg/kg和10 mg/kg剂量组的血清睾酮水平显著降低，而黄体生成素和卵泡刺激素水平保持不变。组织学和免疫组化分析显示莱迪希细胞数量减少，类固醇生成相关基因（STAR、LHCGR、SCARB1、CYP11A1和INSL3）的表达下降。睾丸氧化应激明显，SOD1、SOD2和CAT活性降低，丙二醛水平升高。自噬相关标志物（LC3B、Beclin1）上调，同时莱迪希细胞中mTOR磷酸化程度降低，4-羟基壬烯醛、8-羟基-2’-脱氧鸟苷和LC3B的染色增强，表明存在氧化应激诱导的自噬。体外实验中，成年莱迪希细胞表现出活性氧（ROS）积累、线粒体膜电位下降和自噬体形成。DPT通过上调DRP1和FIS1、下调MFN1并激活PINK1-PARKIN介导的线粒体自噬来增强线粒体分裂。分裂抑制剂mdivi-1可减轻线粒体碎片化，减少自噬并部分恢复类固醇生成。这些发现表明，DPT通过氧化应激、线粒体分裂和线粒体自噬机制破坏莱迪希细胞功能，最终导致睾酮生成受到抑制和精子生成受损。针对线粒体动态的治疗可能有助于保护类固醇生成细胞免受毒素损伤。
引言
有机锡化合物（如三苯基锡TPT）在全球范围内被广泛用作农业杀菌剂、海洋涂料中的防污剂和杀软体动物剂，因其对真菌和水生生物的高效性而受到重视[1]。2021年的一项新研究估计，全球每年有机锡的产量为40,000-51,000吨[2]，导致环境中有机锡含量增加。TPT在环境中并不完全稳定，会经历非生物和生物降解过程，主要转化为二苯基锡（DPT）[3][4]。虽然DPT的急性毒性低于TPT，但它仍具有有机锡的持久性、抗矿化能力和生物累积潜力。
环境监测显示，在沉积物、地表水和生物体中都检测到了TPT和DPT，尤其是在历史上使用过防污涂料的沿海和河口地区[5]。人类主要通过摄入受污染的海产品（尤其是双壳类动物和鱼类）以及在制造、配制或应用含TPT的产品过程中接触这些化合物而暴露于其中[6]。
生物监测数据证实，美国纽约的室内灰尘中存在包括DPT在内的有机锡降解产物[7]。鉴于DPT在环境中的持久性、生物累积潜力以及对人类的可测量影响，全面评估其环境归趋、暴露途径和毒理学意义对于保护公众健康和制定监管策略至关重要。
有机锡被认为是内分泌干扰物。其中，TPT已被广泛研究。TPT可导致男性和女性不孕[8]，干扰雄性大鼠睾丸的发育[9]，损害生殖系统并降低精子活力和精子质量[10]。子宫内暴露于TPT还会显著阻断雄性胎儿大鼠睾丸中的雄激素合成并下调类固醇生成相关基因的表达[11]。作为TPT在环境中的非生物和生物降解产物，DPT是否会影响男性生殖系统尚不明确。在本研究中，我们探讨了DPT暴露对青春期大鼠莱迪希细胞（产生雄激素的细胞）发育的影响。
莱迪希细胞在男性生殖发育和功能中起关键作用。青春期期间，未成熟的莱迪希细胞经历逐步成熟过程，转变为成熟的莱迪希细胞，其特征是形态变化、激素反应性和最大睾酮（T）生成能力的获得[12]。睾酮驱动精子生成、第二性征发育和维持男性生育能力。在这个敏感阶段，莱迪希细胞的发育/功能受到干扰可能导致长期生殖障碍[12]。尽管莱迪希细胞分化的激素调节机制已得到充分研究[13]，但环境因素（如DPT）对这一过程的影响尚不完全清楚。
青春期是大鼠睾丸的一个独特发育时期，在此期间，前体细胞和未成熟的莱迪希细胞增殖，类固醇生成机制上调，睾酮生成量增加，为成年后的生殖能力做准备[14]。这一过程的紊乱可能导致莱迪希细胞成熟不完全、睾酮生成不足和精子生成缺陷。由于成年莱迪希细胞起源于青春期的未成熟细胞，其发育的任何延迟或障碍都可能产生持久影响。先前的研究表明，莱迪希细胞成熟障碍通常与线粒体结构变化、胆固醇转运蛋白（如类固醇生成急性调节蛋白STAR）表达下降以及睾丸内氧化应激增加有关[15][16]。然而，环境化合物（DPT）暴露与这些缺陷之间的精确分子机制尚未完全阐明。
在本研究中，我们探讨了DPT暴露对青春期大鼠莱迪希细胞发育和功能的影响。实验设计为从出生后第35天（PND）到第57天通过口服给予DPT，这一时期对应于莱迪希细胞的活跃成熟期。这种方法允许同时评估全身激素变化和直接的睾丸指标。
化学物质和试剂
DPT氯化物购自Sigma-Aldrich（美国密苏里州圣路易斯）。引物序列列于补充表S1中，抗体信息见补充表S2。玉米油（溶剂）用于溶解DPT。
动物和饲养条件
30天的雄性Sprague-Dawley大鼠购自上海实验动物中心（中国上海）。实验前动物适应一周。大鼠在受控的环境条件下饲养（12小时光照/黑暗）
DPT处理后的体重：身体、睾丸和附睾
从出生后第35天（PND35）到第57天（PND57），大鼠分别接受0、2.5或10 mg/kg的DPT处理（图1A）。在整个处理期间及处理结束后，DPT处理并未改变大鼠的体重（见补充信息表S3）。同样，处理结束时的睾丸和附睾重量与对照组无显著差异（见补充信息表S3）。这些结果表明，所使用的剂量不会引起大鼠的明显毒性。
DPT在体内降低血清睾酮水平
在PND57时处死大鼠，测量血清睾酮（T）、E2和P4水平。
讨论
据我们所知，本研究首次提供了体内和体外证据，证明DPT通过氧化应激诱导的线粒体功能障碍、过度线粒体分裂和PINK1-PARKIN介导的线粒体自噬机制直接抑制莱迪希细胞的类固醇生成。虽然有机锡（包括TBT和TPT）已被证实与鱼类和哺乳动物的内分泌紊乱有关[9][11][23][24]，但关于DPT的生殖毒性的信息仍然有限。
结论
总之，本研究表明，DPT暴露在晚青春期雄性大鼠中特异性地抑制了莱迪希细胞的类固醇生成并损害了精子生成，而不影响上游的促性腺激素水平。机制上，DPT诱导氧化应激，降低抗氧化防御能力，破坏线粒体膜电位，并引发过度线粒体分裂。这种动态失衡激活了PINK1-PARKIN介导的线粒体自噬，导致线粒体耗竭和睾酮生成能力下降。
CRediT作者贡献声明
陈念慈：撰写——初稿，实验研究。田莉莉：方法学，实验研究。胡春楠：方法学，实验研究。葛仁山：撰写——审稿与编辑，资金获取，概念构思。刘毅：撰写——审稿与编辑，概念构思。陈全旭：方法学，实验研究。朱阳：实验研究。朱琪琪：撰写——初稿，实验研究。于建勤：撰写——初稿，实验研究。李兴旺：撰写——审稿与编辑，概念构思。
利益冲突声明
? 作者声明没有已知的可能影响本文研究的财务利益或个人关系。
致谢
本研究得到了浙江省自然科学基金（ZCLQN25H0404）和国家自然科学基金（NSFC 82371610）的支持。我们感谢温州医科大学科研中心的咨询和仪器支持。
