《International Journal of Biological Macromolecules》：A carboxymethyl chitosan-based responsive dual-crosslinked hydrogel loaded with diosmetin for traumatic wound healing
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创伤修复、双交联水凝胶、pH响应、二氢杨梅素、抗菌抗炎抗氧化
作者：张叶、崔大鹏、范双、杨成、李国伟、崔嘉欣、王涛、李磊、于瑞霞、乔月欣、费建东、李明
河北北方大学研究生院，中国河北省张家口市，075000
摘要
创伤性伤口具有不规则的几何形状和复杂的微环境，这给治疗带来了巨大挑战。细菌侵袭、氧化应激以及持续的炎症严重阻碍了组织再生。传统的清创方法本质上具有侵入性，不仅会对健康组织造成附带损害，也无法提供持续的治疗干预。本文设计了一种智能的pH响应型双交联水凝胶（CODEXD），其中封装了具有生物活性的黄酮类化合物二氧梅亭（DIO），该水凝胶基于CMCSMA和氧化葡聚糖（ODex）制备。动态Schiff碱连接和光引发自由基聚合的结合使该系统具有优异的注射性能和原位凝胶化能力，同时能够根据细菌产生的酸性微环境实现按需释放药物。体外评估表明，这种水凝胶具有显著的抗菌、抗炎和抗氧化作用，能有效将巨噬细胞的表型从促炎状态M1转变为促愈合状态M2。使用C57BL/6小鼠的全层皮肤缺损模型进行的体内评估显示，CODEXD通过促进血管生成和增强胶原蛋白沉积显著加速了伤口愈合。总体而言，这种开发的水凝胶为有效管理创伤性伤口提供了一种有前景的治疗策略。
引言
创伤是常见的外科紧急情况，通常伴随着不同程度的软组织损伤[1]。皮肤作为身体的天然防御屏障，一旦其结构完整性受到创伤破坏，就会成为外源性病原体侵入伤口床和深层组织的通道[2]。早期治疗不力常常导致伤口恶化并加重病理状况[3]。因此，外科清创仍然是解决这些临床问题的金标准[4]。尽管这种方法在减轻并发症方面有效，但由于其对健康组织的附带损害以及清创不完全导致的重复手术需求，这种侵入性干预措施仍存在问题。这种医源性创伤对脆弱人群（如老年人、糖尿病患者和免疫功能低下者）尤其有害，因为它可能会延迟伤口愈合并加剧全身炎症[4]。鉴于生物医学材料的快速发展，迫切需要设计一种新的敷料策略，既能重塑伤口修复微环境，又能有效克服外科清创的固有局限性[5]。
从生理学角度来看，伤口愈合涉及四个连续且相互重叠的动态复杂阶段：止血、炎症、增殖和组织重塑[6]。创伤发生后，伤口愈合过程不可避免地进入一个由细菌微环境、炎症失调和活性氧（ROS）爆发共同驱动的动态病理过程[7][8]。在不规则的伤口床中，不受控制的细菌增殖会形成强大的生物膜，产生局部酸性环境，这不仅增强了细菌对抗生素的耐受性，还严重损害了浸润的免疫细胞的功能[9][10]。然而，这也为设计响应刺激的药物输送系统提供了理想的条件[11]。伤口愈合的早期阶段特征是先天免疫细胞（尤其是中性粒细胞和巨噬细胞）的快速募集，这些细胞会大量分泌促炎细胞因子[12]。此外，由局部死腔和坏死组织形成的物理屏障会持续释放促炎信号[13]。关键的是，过度激活的炎症环境使巨噬细胞停留在促炎状态M1，从而阻碍它们及时向促愈合状态M2的转变[14][15]。此外，细胞的“呼吸爆发”会引发活性氧（尤其是超氧阴离子和过氧化氢）的爆炸性生成，导致严重的氧化应激。这种氧化损伤会损害健康成纤维细胞和内皮细胞的活力，从而加剧组织坏死[16][17][18]。此外，这些活性物质还会激活NF-κB信号通路，放大促炎细胞因子的分泌。这建立了一个有害的“炎症-活性氧”正反馈循环，使伤口陷入持续的炎症状态[19][20][21]。因此，重塑病理微环境是加速创伤性伤口愈合的一个有前景的治疗途径。
生物来源的多糖水凝胶因其出色的生物相容性和可降解性而成为先进伤口管理的首选材料[22][23][24]。其中，壳聚糖特别受到关注，因为它具有独特的天然阳离子特性，赋予其广谱抗菌效果[25][26]。从结构上看，该聚合物骨架富含反应性的氨基（-NH2）和羟基（-OH）基团，为多糖提供了丰富的化学功能化位点[27]。改性的壳聚糖具有可编程的三维交联网络，能够有效模拟天然细胞外基质，从而成为细胞粘附的坚固支架[28][29]。在此基础上，进一步提高其临床应用价值的关键步骤是采用合理的交联策略，使水凝胶在复杂的伤口微环境中具备无缝的适应性 và 智能响应性。与传统预成型敷料相比，原位形成的水凝胶能够覆盖不规则的伤口形状，最大化止血效果和物理屏障的完整性[30][31]。迄今为止，已有研究使用多种凝胶化策略（从酶催化和离子相互作用到共价化学交联和超分子自组装）制备了多种单交联或双交联水凝胶系统[32]。其中，光交联水凝胶因其快速的凝胶化动力学和精确的时空可控性而成为强有力的候选材料[33]。此外，基于自由基聚合构建的坚固共价网络赋予这些支架出色的机械稳定性[33]。同时，响应刺激的水凝胶成为伤口修复研究的热点，因为它们能够感知并响应微环境的变化，从而动态调节愈合过程[34][35]。已经开发出对温度、光、葡萄糖和活性氧等多种刺激响应的水凝胶敷料[36][37][38][39][40]。值得注意的是，pH响应型水凝胶对细菌产生的酸性环境具有智能敏感性，能够精确地按需释放治疗载荷[41][42]。尽管已经开发出多种具有pH响应性或双交联结构的壳聚糖基水凝胶，但这些系统在实际应用中常常难以克服伤口修复过程中的临床难题。由于溶解度较低，天然壳聚糖的载药能力有限，难以有效缓解严重的氧化应激和持续的炎症。在交联设计方面，现有的双交联平台往往过于强调机械增强，从而锁定了三维网络，严重影响了水凝胶对局部刺激的敏感性。目前，仅依赖单一动态共价网络的pH响应型水凝胶在遇到酸性病理微环境时容易发生结构崩解，导致治疗药物的不受控制的释放和物理屏障完整性的丧失。因此，平衡机械强度和智能响应性对于水凝胶敷料有效适应动态伤口愈合周期至关重要。
二氧梅亭是一种广泛分布于柑橘属植物中的生物活性天然黄酮类化合物[43][44]。其黄酮骨架中的特定酚羟基和C2-C3双键结合赋予了其多方面的治疗潜力[45]。越来越多的证据表明，它具有出色的抗氧化、抗炎和调节巨噬细胞表型的作用[46][47]，以及优异的抗菌活性[48][49]。总体而言，二氧梅亭的这些生物活性对于在关键炎症阶段优化微环境至关重要，从而在加速伤口愈合中发挥重要作用。然而，以往的研究主要集中在代谢和系统性疾病上，通常采用口服或腹腔内给药途径。这种被动的全身给药方式无法响应伤口愈合过程中的变化，从而无法实现精确和按需的药物输送[50][51]。此外，由于二氧梅亭的治疗效果依赖于剂量[52]，确定其最佳剂量以获得最佳生物效应至关重要。
本文报道了一种用于创伤性伤口的二氧梅亭负载双交联水凝胶，该水凝胶通过Schiff碱连接和光引发自由基聚合制备。首先合成甲基化羧甲基壳聚糖（CMCSMA）和氧化葡聚糖（ODex），然后通过顺序交联策略制备目标CODEXD水凝胶。简而言之，将CMCSMA、ODex和二氧梅亭混合后形成初级Schiff碱网络；随后进行紫外线（UV）照射引发自由基聚合，形成最终的双交联结构。这种设计将机械调控与环境响应性分离。一方面，稳定的碳-碳双键网络为支架提供了足够的机械支撑，防止水凝胶整体崩解和药物突然释放；另一方面，不受刚性网络的限制，Schiff碱连接保持了其对病理微环境的高敏感性。该系统实现了按需给药模式，在炎症阶段响应细菌微环境快速释放药物，在修复阶段持续释放药物，旨在重塑伤口微环境。我们制备了不同剂量二氧梅亭负载的CODEXD水凝胶，系统评估了它们的抗菌、抗氧化、抗炎和免疫调节作用，以及促进细胞迁移的能力。同时，我们还评估了其pH响应性的药物释放特性和理化性质，并在C57BL/6小鼠的全层皮肤缺损模型中评估了其促愈合效果。
材料
甲基丙烯酸酐（MA，94%）、过碘酸钠（NaIO4，99.5%）、葡聚糖（Mw = 500 kDa）和CMCS（取代度≥90%，Mw = 50-200 kDa）购自上海麦克林生化有限公司（中国上海）。二氧梅亭购自上海宇源生物科技有限公司（中国上海），其余试剂购自中国医药化工试剂有限公司（中国上海）。
CMCSMA的制备
1克CMCS在100毫升去离子水中溶解，并在持续搅拌下...
CMCSMA和ODex的合成与表征
如图1A和C所示，通过与MA反应，活性碳-碳双键被引入CMCS骨架中作为光交联位点。傅里叶变换红外光谱（FT-IR）在1661 cm?1、1534 cm?1和1218 cm?1处检测到新的吸收峰，分别对应于酰胺I（C-O伸缩）、酰胺II（N-H弯曲）和酰胺III（C-N伸缩）振动（图1C）。此外，1H NMR光谱在5.41 ppm和5.63 ppm处显示出新的峰，这些峰归属于两个非等价的烯烃基团...
结论
本研究成功开发了一种pH响应型双交联水凝胶，其中负载了二氧梅亭。通过将动态Schiff碱连接与光引发自由基聚合相结合，该系统不仅赋予水凝胶优异的注射性能和快速的原位凝胶化能力，还实现了针对细菌产生的酸性微环境的智能、按需药物释放...
CRediT作者贡献声明
张叶：撰写 – 审稿与编辑、撰写 – 原稿、方法学、实验研究。崔大鹏：撰写 – 原稿、方法学、实验研究。范双：撰写 – 原稿、方法学、实验研究。杨成：方法学。李国伟：方法学。崔嘉欣：方法学。王涛：方法学。李磊：实验研究。于瑞霞：方法学、实验研究。乔月欣：方法学、实验研究。费建东：撰写 – 审稿与编辑、验证、监督
致谢
本研究得到了中国河北省自然科学基金（项目编号：H2024405016）、北京市自然科学基金（项目编号：7262135）、河北省财政项目（项目编号：ZF2023241）以及北京大学人民医院研究与发展基金（项目编号：RDJP2025-14）的支持。
