《International Journal of Biological Macromolecules》：A universal strategy based on a multifunctional DNAzyme biomineralized nanodevice for imaging low-abundance proteins
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DNAzyme生物矿化纳米装置实现肿瘤微环境中VEGF的高灵敏度成像，通过抗体-适配体双识别机制触发DNAzyme级联反应，利用Mn2?自供给和切割产物反馈放大荧光信号，检测限达24.7 fM，可扩展检测其他低丰度蛋白。
郭伟|范明珠|孙志生|黄华贵|莫贵春|罗志辉|徐家耀|梁玲|王世龙
中国广西壮族自治区玉林师范学院化学与食品科学学院农业资源化学与生物技术重点实验室
摘要
异常蛋白质表达与多种疾病的发病和进展密切相关，因此实时体内蛋白质监测对疾病诊断具有重要意义。本文开发了一种可生物降解且辅因子自给的多功能DNA酶仿生矿化纳米装置，用于体内低丰度蛋白质的催化放大成像。该纳米装置通过原位封装两种含有目标蛋白表位序列和部分DNA酶序列（P1和P2）的抗体标记核酸链，以及一个带有荧光团和淬灭剂的分子信标（H1）到pH响应性的掺锰碳酸钙纳米颗粒中制成。在肿瘤部位积累并被细胞内化后，该纳米装置在弱酸性的细胞内环境中分解。目标蛋白特异性识别与抗体结合的P1和P2，从而生成完整的DNA酶序列。此外，从纳米装置释放出的Mn2?离子激活DNA酶，使其切割分子信标并恢复荧光。切割后的分子信标产物可以重新与P1和P2杂交，触发迭代反应，从而将蛋白质放大分析转化为核酸放大分析，实现低丰度蛋白质的敏感体内成像。以血管内皮生长因子（VEGF）为模型，该纳米装置对VEGF的检测限达到24.7 fM。此外，VEGF的体内荧光成像能够清晰区分肿瘤组织和正常组织。通过简单替换相应的适配体序列和抗体分子，该纳米装置可轻松扩展用于检测其他生物分子，为低丰度生物分子的高灵敏度体内成像提供了有前景的工具。
引言
蛋白质是调节几乎所有生理过程不可或缺的生物分子，并与许多疾病的发病和进展密切相关[1]、[2]、[3]。例如，异常蛋白质表达与肿瘤增殖、侵袭和转移密切相关，使蛋白质成为早期癌症诊断的宝贵生物标志物[4]、[5]。抗原-抗体识别已被广泛用于生物系统中的原位蛋白质检测，包括免疫组织化学和免疫荧光成像[6]、[7]。此外，基因编码策略（如SunTag系统）通过信号放大机制实现活细胞蛋白质追踪[8]。然而，传统的免疫荧光方法通常需要固定或渗透过的样本，并且缺乏对活体内低丰度目标的固有信号放大[9]。同时，基因编码方法依赖于基因编辑或外源蛋白质表达，这可能限制其在某些生物学和临床背景下的应用[10]。近年来，开发了多种探针，包括核酸适配体、有机荧光团和抗体功能化纳米材料，用于细胞内和体内蛋白质成像[11]、[12]、[13]、[14]、[15]、[16]。尽管这些探针具有简单性和多功能性等优点，但它们通常依赖于一对一识别机制，导致灵敏度较低，限制了其对超低丰度蛋白质的可视化。因此，开发一种无需基因修饰即可实现活体内内源性蛋白质高灵敏度放大成像的策略仍然非常有必要。
为了提高检测灵敏度，多种核酸放大策略（包括滚环放大（RCA）、链置换放大（SDA）、DNA酶放大、杂交链反应（HCR）和催化发夹组装（CHA）已被应用于活细胞和体内的蛋白质成像[17]、[18]、[19]、[20]。与传统的一对一识别探针相比，这些方法显著提高了检测灵敏度。然而，它们在体内的实际应用仍受到限制。首先，许多核酸放大系统依赖外部提供的酶或辅因子来启动催化反应。其次，大多数系统的放大效率受到限制，因为反应产物无法有效参与后续的催化循环。第三，探针在复杂生物环境中的稳定性和递送效率仍然是体内应用的关键挑战。在这些方法中，DNA酶因其高催化活性、可编程性、稳定性和易于合成而受到特别关注[21]、[22]、[23]、[24]、[25]。特别是离子依赖型DNA酶已被用于构建人工纳米装置，用于金属离子、核酸、小分子和蛋白质的放大成像[26]、[27]、[28]、[29]、[30]。然而，大多数基于DNA酶的成像纳米装置在细胞或体内的放大效率仍然有限，因为切割产物无法有效反馈到反应循环中[31]、[32]、[33]。此外，它们的细胞内活性通常需要外部辅因子，这增加了实验复杂性并降低了检测准确性[34]、[35]。这些限制阻碍了DNA酶系统在超低丰度蛋白质生物标志物早期成像中的应用。因此，开发一种具有辅因子自给性和切割产物驱动的自反馈放大的DNA酶策略对于体内蛋白质生物标志物的监测具有重要意义。
近年来，多种载体系统已被用于实现基于DNA酶的辅因子自给策略，用于体内生物分子的检测[36]、[37]。金属碳酸盐纳米材料（如碳酸钙（CaCO?）和碳酸锰（MnCO?）因其易于合成、低成本、优异的生物相容性和独特的物理化学性质而成为极具吸引力的平台[38]、[39]、[40]。它们的高载药能力和pH响应性降解性使其成为药物、核酸和成像剂的理想载体[41]、[42]、[43]、[44]、[45]。最近的研究进一步揭示了它们作为辅助辅因子供体的潜力，能够在生理条件下提供离子以激活DNA酶反应[46]、[47]。据我们所知，尚未有报道利用DNA酶与金属碳酸盐纳米材料结合构建自给辅因子纳米装置的低丰度蛋白质信号放大体内成像策略。
在本研究中，我们开发了一种新型的辅因子自给且切割产物驱动的自反馈DNA酶仿生矿化纳米装置，用于体内低丰度蛋白质的放大成像。通过仿生矿化方法，我们通过原位封装含有抗体、目标蛋白识别序列和部分DNA酶片段的DNA链以及一个分子信标，简单地构建了一种辅因子自供应的钙-锰碳酸盐DNA酶纳米装置（DND）。该纳米装置对pH敏感，在弱酸性的细胞内环境中溶解，从而释放分子响应元件。两条携带抗体和适配体序列的DNA链可以快速识别目标蛋白，并通过邻近效应组装成完整的DNA酶催化序列。在纳米装置提供的足够Mn2?作为辅因子的情况下，DNA酶特异性切割分子信标，恢复荧光信号。此外，切割后的DNA片段可以作为触发剂，驱动额外的反应循环，从而实现对目标蛋白的高灵敏度成像分析。这种方法为现有的基于抗体和基因编码的方法提供了补充。
试剂和设备
氯化钙（CaCl?）、氯化锰（MnCl?）和四甲基偶氮二甲酸酯（MTT）购自Aladdin Bio-Chem Technology Co., Ltd.（上海，中国）。ELISA细胞因子试剂盒购自BD Biosciences（美国）。甲胎蛋白（AFP）、Survivin蛋白（SUR）、血管内皮生长因子（VEGF）和癌胚抗原（CEA）由New England Biolabs（英国）提供。胎牛血清（FBS）和Dulbecco改良Eagle培养基（DMEM）购自Gibco
基于DNA酶的VEGF信号放大纳米装置原理
设计了一种具有自供辅因子和产物反馈的DNA酶矿化纳米装置，作为目标，为了提高复杂生物环境中蛋白质识别的可靠性，采用了结合抗体和蛋白质适配体的双重识别策略，以实现肿瘤相关低丰度蛋白质的精确成像（图1）。在该系统中，适配体作为主要的分子识别元件，触发下游的DNA组装
结论
总之，我们开发了一种新型的基于DNA酶的纳米装置，具有辅因子自给性和自反馈能力，能够实现对活细胞和体内VEGF的敏感成像。该装置通过仿生矿化方法构建，实现DNA和抗体的原位封装，保护它们免受酶促降解。该纳米装置对多种体内刺激（如微酸性的肿瘤微环境和肿瘤相关蛋白）的响应性显著提高
CRediT作者贡献声明
郭伟：撰写——原始草稿、研究、数据分析、数据管理。
范明珠：撰写——原始草稿、研究、数据分析。
孙志生：方法学、研究。
黄华贵：方法学、研究。
莫贵春：方法学、研究。
罗志辉：方法学、研究。
徐家耀：撰写——审稿与编辑、监督、资金获取、概念构思。
梁玲：撰写——审稿与编辑、监督、资金获取。
利益冲突声明
作者声明他们没有已知的可能会影响本文工作的竞争性财务利益或个人关系。
致谢
本工作得到了广西自然科学基金（2024GXNSFBA010251、2024GXNSFAA010250）、国家自然科学基金（22364021）、广西大学青年和中年教师研究基础能力提升项目（2024KY0125、2025KY0680）以及八桂青年顶尖人才计划的支持。
