负载姜黄素纳米颗粒的潘加西亚鱼（Pangasianodon Hypophthalmus）胶原蛋白/PVA生物活性水凝胶通过调节TGF-β1和MMP-9的表达来加速伤口愈合

《International Journal of Biological Macromolecules》：Curcumin nanoparticles loaded Pangasianodon Hypophthalmus fish collagen/PVA bioactive hydrogel accelerates wound healing by modulating TGF-β1 and MMP-9 expression

本研究成功制备了姜黄素纳米颗粒（CNPs）负载的条纹鲶鱼皮胶原蛋白/聚乙烯醇（CNPs@COL/PVA）水凝胶，其具有pH响应性（膨胀率达1337%）、良好生物降解性（14天内降解50-60%）、优异的机械性能及高生物相容性（细胞存活率>85%）。经伤口scratch实验证实，该水凝胶可显著促进伤口愈合（闭合率94.92%），并通过调控TGF-β1（1120.13 pg/mL）和MMP-9（5.71 ng/mL）表达抑制炎症反应。首次将鱼源胶原蛋白应用于水凝胶开发，为可持续伤口敷料提供新方案。

　　

Md Shaekh Forid | Mohd Hamzah Bin Mohd Nasir | Muhammad Saupi Azuri | Wan Maznah Wan Ishak

马来西亚彭亨大学Al-Sultan Abdullah化学与过程工程技术学院 地址：Lebuhraya Persiaran Tun Khalil Yaakob, 26300, Gambang, Kuantan, Pahang, Malaysia

摘要

有效的伤口愈合仍然是一个全球性挑战，因为传统的敷料往往阻碍了恢复过程。水凝胶提供了一种生物相容的替代方案，能够维持有利于愈合的湿润环境。然而，载有生物活性药物的水凝胶在临床应用中仍然受到限制。尽管姜黄素具有治疗潜力，但由于其溶解度低和皮肤渗透性差，在局部使用方面存在局限性。此外，对牛源和猪源胶原蛋白（COL）的担忧促使人们开始关注替代生物材料。在这项研究中，通过将姜黄素纳米颗粒（CNPs）结合到来自Pangasianodon hypophthalmus皮肤的I型胶原蛋白和聚乙烯醇（PVA）基质中，开发出一种生物活性水凝胶。通过氨基酸分析、FTIR和SDS-PAGE确认了胶原蛋白的身份。制备的姜黄素纳米颗粒大小为118纳米。姜黄素纳米颗粒负载的胶原蛋白/PVA（CNPs@COL/PVA）水凝胶表现出pH响应性膨胀（在pH 5.4时膨胀率达到1337%）、生物降解性（14天内降解50–60%）、最佳水蒸气透过率（2216.68 ± 65.37 g/m2/天）、孔隙率（59.32 ± 3.34%）以及优异的机械性能。结构完整性通过FTIR、XRD和FESEM得到了验证。在3T3-L1细胞上的生物相容性得到了确认（存活率超过85%）。伤口划痕实验显示，162.5 μg/mL的CNPs@COL/PVA水凝胶比天然水凝胶（78.78 ± 3.94%）更能促进伤口闭合。体外实验表明，该水凝胶在72小时内的皮肤渗透率为49.78 ± 1.37%，并且药物释放遵循Korsmeyer–Peppas动力学（R2 = 0.944）。值得注意的是，CNPs@COL/PVA水凝胶显著上调了TGF-β1（1120.13 ± 99.21 pg/mL）并下调了MMP-9（5.71 ± 0.55 ng/mL），表明其对伤口愈合具有积极的分子效应。这些发现支持其作为先进伤口敷料的潜力。

引言

伤口愈合是一个复杂而动态的生物过程，包括炎症、增殖和重塑等多个阶段，旨在恢复受损组织的结构和功能完整性[1]。这一过程受到复杂的细胞和分子相互作用调节，包括成纤维细胞增殖、血管生成、胶原蛋白（COL）沉积以及转化生长因子-β1（TGF-β1）和基质金属蛋白酶-9（MMP-9）等细胞因子和生长因子的调节。然而，由于各种原因，伤口有时无法完全愈合，因此慢性伤口问题在临床实践中仍然非常严重。目前常用的伤口敷料如纱布、棉絮和绷带（由天然或合成材料制成）往往无法在伤口界面保持足够的湿润度，经常导致组织粘连、皮肤刺激、不适以及愈合延迟，并增加二次创伤的风险[2],[3],[4]。因此，开发能够主动调节伤口微环境并加速愈合的先进生物活性敷料已成为再生医学和生物材料研究的主要焦点。

如今，现代伤口护理创新包括基于生物聚合物的敷料，如半透膜、半透泡沫、水胶体、纳米纤维和水凝胶[5]。其中，水凝胶因其优异的特性而备受关注。水凝胶由三维聚合物网络组成，来源于天然或合成材料，具有高柔韧性和显著的保水性[6],[7]。这种结构使水凝胶具有类似组织的柔软性，适用于多种生物医学应用（Ullah等人，2015年）。水凝胶能够保持大量水分，其生物相容性、生物降解性、无毒性和抗菌性取决于具体的聚合物组成和配方[4],[8]。水凝胶可以使用天然聚合物（如COL、壳聚糖、透明质酸和藻酸盐）或合成聚合物（如聚乙烯醇（PVA）、聚乙二醇（PEG）或其组合来制备[7],[9]。这些基于天然聚合物的水凝胶对皮肤具有生物相容性，可生物降解且无毒。此外，天然聚合物由于其固有的生物识别能力和与细胞外基质的相似性，常被用于伤口敷料[10]。天然和合成聚合物都可以被改造成具有高度孔隙性的水凝胶，适用于控制药物释放系统。然而，单一聚合物无法提供伤口敷料所需的所有特性。因此，将天然生物聚合物和合成聚合物结合使用对于改善水凝胶的膨胀性和机械性能具有前景。

COL是动物来源中最丰富和普遍存在的蛋白质，约占哺乳动物总蛋白质含量的30%，在形成骨骼、软骨、肌腱和皮肤等结缔组织中起着关键作用[11]。除了结构功能外，COL还表现出显著的生物活性，通过促进细胞增殖和分化、促进凝血以及促进血管生成和血管成熟来帮助伤口修复[12]。COL还具有良好的生物相容性和生物降解性。传统上，广泛使用牛源和猪源COL[12]。然而，由于人畜共通疾病传播的担忧、宗教限制和高成本，人们开始探索海洋和淡水鱼类COL作为可持续的替代品[13]。因此，基于鱼类的COL可能是克服这一限制的水凝胶开发的替代选择。

鱼类来源的COL具有多种优势，包括较低的抗原性、更好的生物降解性和来自鱼类加工副产品的丰富来源。Pangasianodon hypophthalmus（条纹鲶鱼）属于鲶鱼科，在马来西亚当地被称为ikan patin或patin hitam，是一种原产于东南亚的淡水鱼类，可以作为替代哺乳动物COL的新来源[14]。根据年龄、饮食和环境等因素，鱼皮中含有约25%至30%的COL。在加工和切片过程中会产生大量鱼皮副产品，这些副产品通常被丢弃，从而造成宝贵资源的浪费，而这些资源可以用于COL提取。先前的研究表明P. hypophthalmus的鱼皮COL属于I型胶原蛋白，具有开发成伤口愈合用水凝胶的潜力[15]。然而，据我们所知，目前还没有研究探讨过使用P. hypophthalmus的COL来开发伤口护理用水凝胶。因此，探索P. hypophthalmus COL的潜力至关重要。此外，单独使用COL的一个挑战是其难以成型和固有的脆弱性。为了解决这些问题，人们经常将COL与其他材料（如壳聚糖、聚乙二醇、透明质酸和PVA）结合使用以增强水凝胶的形成[16]。其中，PVA因其亲水性、无毒性和出色的成膜能力以及机械性能而特别值得注意。

将生物活性分子掺入COL/PVA水凝胶中可以进一步增强其治疗潜力。姜黄素是从姜黄（Curcuma longa）中提取的一种生物活性多酚类天然疏水化合物。姜黄素具有多种药理作用，包括抗氧化、抗菌、抗炎、抗癌、抗突变和抗凝血作用。此外，姜黄素还表现出显著的伤口愈合效果[17],[18],[19]。研究表明，局部应用姜黄素在伤口愈合过程中具有积极作用，如促进组织重塑、肉芽组织形成和COL沉积[18],[20]。然而，由于姜黄素的溶解度低和皮肤渗透性差，开发有效的姜黄素局部制剂具有挑战性[21]。为了解决这些问题，研究人员探索了基于水凝胶的递送系统来增强姜黄素的治疗效果。此外，载有姜黄素纳米颗粒（CNPs）的水凝胶系统可以通过克服姜黄素的溶解性和渗透性问题显著提高伤口敷料的效果。

在本研究中，通过物理交联方法制备了载有P. hypophthalmus鱼皮COL的CNPs@COL/PVA水凝胶（方案1），并通过3T3-L1成纤维细胞的伤口划痕实验评估了其理化性质、机械性能、生物相容性和伤口愈合效果。进行了体外皮肤渗透研究，并研究了CNPs从伤口敷料材料中的释放机制。此外，还研究了所制备的水凝胶对TGF-β1和MMP-9基因表达的调节作用，这两种基因是控制成纤维细胞激活、COL合成和ECM重塑的关键生物标志物。这项工作为鱼类COL和CNPs在加速伤口修复方面的协同作用提供了新的见解。据我们所知，这是首次报道使用P. hypophthalmus鱼皮COL开发CNPs@COL/PVA水凝胶用于伤口敷料的案例。这些发现有望促进可持续、经济高效且高效的生物活性敷料的发展，以用于临床伤口管理。

材料

姜黄素（纯度≥94%）和二氯甲烷购自Sigma-Aldrich（美国）。聚乙烯醇（PVA；分子量85,000–124,000 g/mol，水解度99%以上）和磷酸盐缓冲盐水（PBS）也购自Sigma-Aldrich（美国）。醋酸、氯化钠和甘油购自R&M Chemicals（马来西亚）。小鼠成纤维细胞3T3-L1细胞系来自美国典型培养物收集中心（ATCC，美国）。Dulbecco改良Eagle培养基/F-12（DMEM/F-12）和胎牛血清（FBS）也用于实验。

姜黄素纳米颗粒的制备和表征

通过动态光散射（DLS）分析表征了制备的姜黄素纳米颗粒的理化性质。平均粒径为118纳米，多分散指数（PDI）为0.203，表明粒径分布狭窄且均匀（图1A）。Zeta电位为-36.31 mV，表明表面电荷高度负，胶体稳定性良好，因为超过±30 mV的值通常表示分散体稳定[34]。如图1B所示，CNPs形成了...

结论

本研究成功使用冻融物理交联方法制备了生物活性CNPs@COL/PVA水凝胶，并对其进行了全面表征。从P. hypophthalmus鱼皮中提取的COL通过氨基酸分析、FTIR和SDS-PAGE确认为I型胶原蛋白。CNPs@COL/PVA水凝胶表现出良好的理化性质和机械性能，包括pH响应性膨胀、最佳孔隙率和生物降解性，从而能够有效保持水分和氧气...

CRediT作者贡献声明

Md Shaekh Forid：撰写——原始草稿、可视化、验证、方法学、研究、数据分析、数据管理。Mohd Hamzah Bin Mohd Nasir：撰写——审稿与编辑、资源提供。Muhammad Saupi Azuri：撰写——审稿与编辑、软件使用。Wan Maznah Wan Ishak：撰写——审稿与编辑、监督、资源获取、概念构思。

未引用的参考文献

[96], [97]

利益冲突声明

作者声明没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文所述的工作。

致谢

作者衷心感谢马来西亚彭亨大学Al-Sultan Abdullah（UMPSA）通过UMPSA基础研究基金（大学参考编号RDU 260312）提供的宝贵财政支持。作者还感谢UMPSA化学与过程工程技术学院（FTKKP）提供的设备和设施，使本研究得以顺利进行。