《ACS Omega》：Studies on a Sulfoxide-Bridged Tn Antigen Mimetic: Interaction with Macrophage Galactose Lectin and Inhibition of Sialyltransferase ST6GALNAC1
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本研究针对肿瘤相关碳水化合物抗原（TACAs，特别是Tn和sTn抗原）免疫原性弱、易与免疫抑制性受体MGL结合以及肿瘤中ST6GALNAC1酶上调导致sTn抗原累积等问题，研究人员合成了硫桥联的Tn-Thr模拟物1及其亚砜类似物2。通过结构分析、结合实验和酶活性测试，揭示了模拟物1/2的构象锁定特性及其与MGL的弱结合作用，并首次发现它们可作为ST6GALNAC1的抑制剂。这项工作为开发新一代抗癌疫苗和靶向异常糖基化的疗法提供了新的设计思路和化学起点。
在癌症的众多特征中，异常的糖基化（Glycosylation）是一个突出且普遍的现象。想象一下，细胞表面原本装饰着复杂精致的糖链（聚糖），如同细胞的“身份标识”和“通讯语言”。然而，在癌细胞表面，这些糖链的合成过程常常不完整，产生出许多“截短”的、结构简单的糖链。其中，Tn抗原（GalNAcα1-O-Ser/Thr）及其唾液酸化形式sTn抗原（Neu5Acα2–6GalNAc-O-Ser/Thr）就是两种在多种上皮癌（如胃癌、结直肠癌、卵巢癌、乳腺癌、胰腺癌）中高表达，而在正常组织中极少见的“肿瘤标志物”。
这些肿瘤相关碳水化合物抗原（Tumor-Associated Carbohydrate Antigens, TACAs）虽然具有肿瘤特异性，被认为是开发癌症疫苗的理想靶点，但在临床应用中却遭遇了“滑铁卢”：它们引发的免疫反应非常微弱。这是为什么呢？科学家们发现，背后主要有两大“元凶”。首先，Tn/sTn抗原会被抗原呈递细胞（如巨噬细胞、树突状细胞）表面的一种名为巨噬细胞半乳糖型凝集素（Macrophage Galactose-type Lectin, MGL）的受体识别并结合。这本是免疫系统发现“敌情”的信号，但MGL的激活非但没有拉响警报，反而会启动免疫抑制程序，例如促进抗炎因子IL-10的产生并诱导效应T细胞凋亡，相当于为癌细胞打开了“免疫逃逸”的后门。其次，Tn/sTn抗原通常“搭乘”在MUC1等粘蛋白（Mucin）上，而这些蛋白在人体内本身就存在（属于“自我”成分），免疫系统对它们容易产生“耐受”，即视而不见。有趣的是，MGL与Tn抗原的紧密结合，高度依赖于Tn抗原上N-乙酰基（NHAc）这一化学基团。
为了打破这种免疫耐受，研究人员之前设计了一种结构稳定的Tn抗原模拟物——2-脱氧-2-硫-α-O-半乳糖苷（化合物1）。它巧妙地用一个硫原子桥联了糖环，使其构象被锁定，同时去除了关键的NHAc基团。前期研究表明，将多个化合物1连接到蛋白载体或纳米颗粒上制成的疫苗，能在小鼠三阴性乳腺癌模型中激发强烈的T细胞依赖性免疫反应。这表明，缺乏NHAc基团很可能使其避免了与免疫抑制性MGL受体的结合，从而“唤醒”了免疫系统。
尽管取得了成功，但谜题仍未完全解开：NHAc基团到底扮演了何种具体角色？它的缺失如何从结构上影响分子与MGL的相互作用？此外，在肿瘤中，Tn抗原常被一种名为ST6GALNAC1的唾液酸转移酶（Sialyltransferase）修饰，加上一个唾液酸，变成sTn抗原。sTn的表达与更高的肿瘤侵袭性和更差的预后相关。那么，能否通过抑制ST6GALNAC1来阻止sTn的产生，从而抑制肿瘤进展呢？目前，尚没有针对ST6GALNAC1的有效抑制剂被报道。
为了解决上述问题，研究人员在化合物1的基础上，进一步合成了其亚砜（Sulfoxide）衍生物（化合物2），即将硫原子进一步氧化为亚砜（S=O）基团，旨在探究引入一个结构与NHAc中羰基（C=O）相似的极性基团后，是否能重新建立与MGL的有效结合。同时，他们也系统评估了化合物1和2对ST6GALNAC1酶活性的影响。这项研究深化了我们对Tn抗原模拟物结构-功能关系的理解，并为开发兼具免疫原性和酶抑制活性的新型抗癌分子提供了线索。相关成果发表在《ACS Omega》期刊上。
为了开展这项研究，作者团队运用了多种关键的技术方法。在化学合成方面，他们通过有机合成方法制备了目标分子，包括使用间氯过氧苯甲酸（mCPBA）进行选择性氧化得到亚砜衍生物。在结构表征与验证方面，他们利用X射线晶体衍射技术解析了关键中间体溴代衍生物3的绝对构型，并通过密度泛函理论（DFT, Density Functional Theory）计算从能量上解释了反应的选择性。在分子相互作用研究方面，他们采用了核磁共振（NMR）光谱学方法，特别是1H–15N异核单量子相干（HSQC）滴定实验，来定性和半定量地分析模拟物与重组MGL碳水化合物识别结构域（MGL-CRD）的结合亲和力与位点。此外，还通过酶联免疫吸附试验（ELISA）在固相条件下验证了多价展示的Tn模拟物与MGL的结合情况。在功能活性评估方面，他们建立了一种基于放射性标记底物（CMP-[3H]Sialic acid）的体外酶活性测定法，使用去唾液酸牛颌下腺粘蛋白（aBSM）作为受体底物，来评估化合物对ST6GALNAC1唾液酸转移酶活性的抑制效果，并计算了半数抑制浓度（IC50）。
研究结果
Synthesis of Sulfoxide 2 (亚砜2的合成)
研究人员以先前开发的Tn-Thr模拟物1为起点，用间氯过氧苯甲酸（mCPBA）对其进行氧化，以69%的产率得到了亚砜衍生物2，并且反应具有高度的立体选择性，只生成单一的非对映异构体。尝试进一步氧化2得到相应的砜类似物未能成功。为了明确所生成亚砜2中硫原子的立体构型，他们合成了更易结晶的溴代衍生物3，并成功培养了适用于X射线衍射分析的晶体。
X-ray Structure of Sulfoxide Derivative 3 (亚砜衍生物3的X射线结构)
通过对溴代衍生物3的单晶X射线衍射分析，研究人员成功确定了化合物2中硫原子的立体构型为S型。晶体结构显示，亚砜（S=O）中的氧原子在空间上指向远离糖环的方向。
进一步的密度泛函理论（DFT）计算比较了生成2-S和2-R两种异构体的反应路径。计算表明，生成2-S的路径其活化能垒比生成2-R的路径低近4 kcal/mol，这从动力学上解释了实验观测到的高选择性。此外，2-S异构体本身也比2-R稳定约6 kcal/mol，表明2-S不仅是动力学优势产物，也是热力学更稳定的产物。
NMR Studies of Sulfoxide 2 and Trivalent Sulfoxide 5 vs MGL and ELISA Tests (亚砜2和三价亚砜5与MGL的NMR研究及ELISA测试)
为了评估化合物与免疫抑制受体MGL的相互作用，研究进行了溶液核磁共振结合实验。他们制备了均一15N标记的MGL碳水化合物识别域（MGL-CRD），并通过1H–15N HSQC滴定监测化学位移扰动（CSPs）。实验发现，无论是单价亚砜2还是设计合成的三价簇状分子5，在与MGL-CRD结合时，都引起了与天然Tn抗原结合时相似的氨基酸残基（如Y236, W271等）的化学位移扰动，表明它们结合在相同的位点。
然而，结合强度非常弱。通过滴定数据定性估算，单价化合物2的表观解离常数（KDapp）约为2.20 ± 0.75 mM（毫摩尔级），而三价化合物5的亲和力有所提高，KDapp约为0.46 ± 0.08 mM。尽管如此，它们的结合力仍远弱于天然Tn抗原与MGL的相互作用。这一结果通过ELISA实验得到了进一步证实：即使将Tn模拟物以多价形式展示在牛血清白蛋白（BSA）上，与MGL的结合也非常微弱或检测不到。这些数据共同表明，用亚砜（S=O）取代NHAc中的羰基（C=O），并未能恢复与MGL的有效结合。这很可能是因为亚砜氧原子的空间取向与天然Tn中NHAc的羰基氧原子不同，无法形成关键相互作用。
ST6GALNAC1 Inhibition (ST6GALNAC1抑制)
本研究的另一个重要发现是评估了化合物1和2对唾液酸转移酶ST6GALNAC1的抑制活性。ST6GALNAC1是肿瘤中sTn抗原上调的关键酶。研究人员建立了体外放射性酶活检测体系，使用去唾液酸牛颌下腺粘蛋白（aBSM）作为受体底物，CMP-[3H]唾液酸作为供体底物。
实验结果显示，化合物1和2均能剂量依赖性地抑制ST6GALNAC1的活性。计算得出的半数抑制浓度（IC50）值分别为3 mM（化合物1）和2.4 mM（化合物2）。尽管抑制效力处于毫摩尔级别，相对较弱，但这是首次报道的针对ST6GALNAC1的单糖类抑制剂。通过对比分析，研究人员估计化合物1和2对ST6GALNAC1的亲和力大约是其天然底物（aBSM上的Tn抗原）的一半。这一发现为后续基于此结构进行优化，开发更强效的ST6GALNAC1抑制剂提供了宝贵的先导化合物（Hit compound）。
研究结论与意义
本研究通过对硫桥联Tn抗原模拟物的深入探索，得出了几项关键结论。首先，化合物1的结构刚性（由硫桥锁定）及其缺乏NHAc基团的特性，是它能够打破对天然Tn抗原的免疫耐受、激发有效免疫反应的结构基础。其次，在化合物1基础上引入的亚砜基团（化合物2），由于其氧原子的空间取向与天然Tn的NHAc羰基氧不同，并未能重建与免疫抑制受体MGL的有效结合，这反过来印证了NHAc基团在MGL识别中的关键作用。最后，也是最重要的一点，研究首次发现化合物1及其亚砜类似物2是ST6GALNAC1酶的抑制剂。虽然目前效力尚不理想，但它们作为该靶点的首个报道的抑制剂，为开发能够调控肿瘤异常唾液酸化（Sialylation）的治疗策略开辟了新的道路。
综上所述，这项工作不仅从分子层面深化了对Tn抗原与MGL相互作用的理解，为设计下一代不结合MGL的免疫原性Tn模拟物提供了明确的指导原则（即避免或改变NHAc结构），还将Tn模拟物的功能从单纯的疫苗抗原拓展到了酶抑制剂领域。在ST6GALNAC1晶体结构尚属未知的当下，这些先导化合物的发现尤为珍贵，它们将成为基于结构进行药物优化设计的重要起点。因此，该研究为开发更有效的MUC1基癌症疫苗和靶向癌症异常糖基化的治疗策略，提供了新的双重机遇：一是通过结构优化增强免疫原性并避免免疫抑制，二是通过抑制关键糖基转移酶阻断促癌的糖链修饰。
