《Analytical Chemistry》：Toward Sustainable Clinical Analysis: Benchmarking Plastic Use in LC–MS Sample Preparation – Exemplified by Ketamine Analogues in Whole Blood
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本研究针对法医分析中样品制备的塑料消耗问题，以全血中氯胺酮类似物为模型，系统评估了蛋白质沉淀(PPT)、液液萃取(LLE)和电膜萃取(EME)三种前处理方法的绿色性。研究不仅成功建立了LC-MS分析方法，还通过AGREEprep评分和塑料消耗量化，提出了塑料使用基准（PPT法约0.5 kg/100样品），并证实EME可显著减少40%的塑料消耗和有机溶剂用量，为发展更可持续的临床/法医化学方法提供了重要参考。
在当代法医毒物学和临床化学实验室中，高通量、高灵敏度的分析技术，如液相色谱-质谱联用(LC-MS)，已成为检测生物样本中痕量药物的金标准。然而，在这些精密仪器“舞台”的背后，一个常常被忽视的“配角”——样品前处理步骤——正悄然带来巨大的环境负担。尤其是其中大量使用的一次性塑料耗材，不仅构成了实验室“塑料足迹”的主要部分，还可能因化学物质浸出而干扰分析结果。与此同时，新型精神活性物质(NPS)的不断涌现，如氯胺酮及其类似物，对公共健康构成持续威胁，亟需建立高效、可靠的检测方法。那么，能否在满足严格分析方法学要求的同时，大幅减少样品前处理过程的塑料消耗和溶剂用量，实现更绿色的分析化学？这正是《Analytical Chemistry》期刊上发表的这项研究所致力解决的核心问题。
研究人员以全血中九种氯胺酮类似物为分析目标，开展了一项兼顾方法开发与绿色性评估的综合性研究。其核心目标是双重的：一是建立一种适用于法医分析的全血中氯胺酮类似物LC-MS多组分检测方法；二是以此次研究为案例，系统评估和比较不同样品前处理技术的绿色性，为实验室的可持续发展提供量化基准。为此，他们选取了三种具有代表性的样品制备技术进行对比：目前在临床实验室中最常用的蛋白质沉淀(PPT)、经典的液液萃取(LLE)，以及一种较新颖但前景广阔的电膜萃取(EME)。研究不仅详细优化了LC-MS条件和EME参数，还创新性地从塑料消耗、有机溶剂用量、操作步骤数和AGREEprep绿色度评分等多个维度，对这三种方法进行了全面的“环境影响”剖析。最终，研究不仅成功验证了基于EME前处理的LC-MS方法，更提出了一个具有普遍参考价值的塑料消耗基准，并指出了未来减少分析化学环境足迹的可能路径。
本研究主要运用了以下几种关键技术方法：
- 1.
样品前处理技术比较：系统比较了蛋白质沉淀(PPT)、液液萃取(LLE)和电膜萃取(EME)三种方法，用于处理人全血样本（来自奥斯陆大学医院血库）。
- 2.
液相色谱-质谱(LC-MS)分析：使用三重四极杆质谱仪，通过优化色谱条件（特别是使用Kinetex Biphenyl色谱柱和甲醇作为有机改性剂）和电喷雾电离(ESI)参数，实现了九种氯胺酮类似物的基线分离和选择性检测。
- 3.
实验设计(DoE)优化：采用Box-Behnken实验设计，先后优化了质谱的ESI条件（如鞘气流量、毛细管电压、喷嘴电压）和EME的萃取参数（如萃取电压、时间和受体相中的甲酸浓度）。
- 4.
方法学验证：依据美国法医科学学会(AAFS)的指南，对所建立的EME-LC-MS方法进行了全面的验证，包括线性、精密度、准确度、检测限(LOD)、定量限(LOQ)、基质效应和残留等。
- 5.
绿色度评估：使用AGREEprep评分系统（一种从0到1，1表示最绿色的定量评估工具），由三名用户独立对三种前处理方法的绿色度进行打分，并计算了每处理100个样品所消耗的塑料总质量。
研究结果
优化的LC-MS条件
通过优化，确定了最佳的质谱多反应监测(MRM)离子对。在色谱分离方面，研究发现使用Kinetex Biphenyl色谱柱（2.1 mm × 100 mm, 1.7 μm）结合甲醇作为有机改性剂，在60°C柱温和0.6 mL/min流速下，成功实现了异构体MXPr和MXiPr的基线分离（分离度R > 1.5）。这与通常的C18柱行为相反，归因于甲醇促进了分析物与固定相之间的π-π相互作用。优化的ESI条件包括：鞘气温度400°C，鞘气流速12 L/min，毛细管电压±2500 V，喷嘴电压±0 V。
三种样品制备方法（PPT、LLE和EME）的比较
在分析方法性能上，PPT、LLE和EME三种方法对大多数氯胺酮类似物都表现出相似的回收率（>85%）和基质效应（约100%）。例外的是最疏水的分析物3-MeO-PCE，其在EME中的性能最初较低，可能与影响其电动力学迁移的理化性质有关。
研究的重点在于对资源消耗和绿色度的量化比较。计算表明，每处理100个样品，三种方法消耗的塑料总量分别为：PPT 511克，LLE 864克，EME 303克。相应的，每样品有机溶剂消耗量分别为470微升、1570微升和210微升。使用AGREEprep工具评估的绿色度平均得分分别为：PPT 0.48 ± 0.04，LLE 0.36 ± 0.04，EME 0.55 ± 0.05（分数越高越绿色）。所有评估者均认为LLE的绿色度最低，而EME最高。评分者间的差异在8%–11%，表明评分系统具有一定稳健性。基于更少的操作步骤、更低的溶剂消耗和更高的绿色度评分，研究选择EME进行后续优化。
优化的EME条件
通过Box-Behnken实验设计优化EME参数发现，受体相中的甲酸(FA)浓度影响 negligible，较高的萃取电压略有优势，而较长的萃取时间则非常有利。基于提高样品通量的实际考虑（即以牺牲部分回收率为代价缩短时间），最终选择的优化条件为：萃取电压70 V，萃取时间15分钟，受体相中甲酸浓度50 mM。此优化显著改善了3-MeO-PCE的回收率，从78%提高至102%。
方法验证
优化后的EME-LC-MS方法根据AAFS指南进行了验证。校准曲线在10-2000 nM（约对应全血浓度2-500 ng/mL）范围内呈线性，涵盖了氯胺酮类似物在血液中的预期浓度范围。该方法对高浓度样品（如过量服用场景）的10倍稀释进行了验证。方法检测限(LOD)为0.5 nM（0.1 ng/mL），定量限(LOQ)为10 nM（2.0-2.6 ng/mL），远低于挪威法定的氯胺酮 per se 限值（0.400 μM，约95 ng/mL）。除3-MeO-PCE外，所有分析物的批内和批间精密度分别在0.9%–15%和0.5%–9.9%之间，基质效应在95%–103%之间。在高浓度（20,000 nM）下评估残留，除3-MeO-PCE（29%）外，所有分析物在后续空白样品中的峰面积均介于最低校准标准的13%至18%之间。虽然略高于AAFS规定的10%上限，但符合欧洲药品管理局20%的标准。总体而言，EME方法适用于氯胺酮类似物的定量分析。
提取耗材的重复使用
为了探索减少塑料消耗的可能性，研究测试了重复使用EME耗材（包括油浸膜、导电塑料样品瓶/不锈钢96孔板）的可行性。结果表明，在更换新的受体溶液后重复使用，产生的残留尚可接受。但在96孔板格式中效果较差，可能由于观察到的死体积更大。尽管在临床/法医领域因生物危害和司法问题难以重复使用耗材，但电萃取技术适合在线操作的特性，为未来开发基于芯片的装置以减少耗材和实现自动化提供了可能。
塑料污染
除了环境问题，塑料还可能污染样品（例如浸出）。研究在非靶向分析（飞行时间质谱，ToF-MS）中观察到了类似的塑料相关污染信号，这些污染可能导致（随机）基质效应。
研究结论与意义
本研究成功建立并验证了一种用于全血中九种氯胺酮类似物检测的EME-LC-MS方法，满足了法医分析的要求。更重要的是，研究对三种常见样品前处理方法的可持续性进行了系统性基准测试。研究发现，与PPT和LLE相比，EME具有操作步骤少、一次性塑料消耗少（比基准减少40%）、有机溶剂用量少以及AGREEprep绿色度评分最高的优势。基于PPT法（当前最常用的方法之一）每处理100个样品消耗约0.5公斤塑料的结果，研究提出了将此数值作为当前样品制备中塑料消耗的实用基准，为未来开发和评估样品制备策略提供了重要的参考点。
电膜萃取(EME)作为一种新兴技术，展现出优异的選擇性和对蛋白质、脂质、磷脂、盐分及多种内源性代谢物的出色净化能力。然而，未来的EME发展应致力于寻找能同时萃取更广疏水性范围分析物的溶剂化学体系，从而减少为覆盖不同性质分析物所需的多方法（及相应的塑料使用）。此外，结合上述优势，开发在线EME萃取应用前景广阔。
最后，研究强调了塑料污染问题的双重性：除了显著的可持续性问题，塑料还可能成为污染源和干扰源，这在样品的全扫描分析中显而易见。这些发现共同指向了一个明确的需求：在分析化学领域，需要减少塑料使用、开发样品制备的在线变体、并寻找替代材料，以应对与塑料相关的可持续性和分析灵敏度问题。这项工作不仅为氯胺酮类似物的检测提供了可靠方案，更重要的是为整个分析化学界朝着更环保、更可持续的方向发展，提供了量化的数据支持和清晰的改进思路。
