Sophflarines F–K：从Sophora flavescens中提取的、基于马涕树碱的生物碱，具备独特的芳香结构，具有抗炎作用及协同抗菌效果

《Natural Products and Bioprospecting》：Sophflarines F–K: matrine-based alkaloids with a rare aromatic system from Sophora flavescens and their anti-inflammatory and synergistic antibacterial effects

　　**摘要**

从Sophora flavescens的水溶性生物碱组分中，通过紫外引导的分离方法获得了六种基于马亭类的新生物碱——sophflarines F–K（1–6），这些化合物具有罕见的芳香体系。通过光谱分析、量子化学计算和X射线衍射数据的研究，阐明了它们的结构。化合物1和2是高度修饰的15,16-seco-17-nor-matrine衍生物，含有罕见的4,5-二氢-3H-吡咯[2,3,4-ij]喹唑啉结构单元；而化合物5则具有独特的6/6/6–5四环骨架。硫酸铜诱导的斑马鱼实验表明，化合物1、4和5在非毒性浓度下表现出中等的抗炎活性。棋盘实验显示，化合物5和6能够增强多粘菌素对大肠杆菌ATCC25922和BW25113-mcr-1的活性，分别使多粘菌素的MIC值降低了16倍和32倍。这些发现扩展了芳香马亭类生物碱的结构多样性，并突显了它们作为抗炎剂和抗菌辅助剂的潜力。

**图解摘要**
从Sophora flavescens的水溶性生物碱组分中，通过紫外引导的分离方法获得了六种基于马亭类的新生物碱——sophflarines F–K（1–6），这些化合物具有罕见的芳香体系。通过光谱分析、量子化学计算和X射线衍射数据的研究，阐明了它们的结构。化合物1和2是高度修饰的15,16-seco-17-nor-matrine衍生物，含有罕见的4,5-二氢-3H-吡咯[2,3,4-ij]喹唑啉结构单元；而化合物5则具有独特的6/6/6–5四环骨架。硫酸铜诱导的斑马鱼实验表明，化合物1、4和5在非毒性浓度下表现出中等的抗炎活性。棋盘实验显示，化合物5和6能够增强多粘菌素对大肠杆菌ATCC25922和BW25113-mcr-1的活性，分别使多粘菌素的MIC值降低了16倍和32倍。这些发现扩展了芳香马亭类生物碱的结构多样性，并突显了它们作为抗炎剂和抗菌辅助剂的潜力。

**1 引言**
Sophora flavescens Ait. 是一种广泛分布于东亚的药用植物，在传统医学中被广泛用于治疗炎症性疾病、胃肠道疾病和寄生虫感染 [1,2,3,4]。植物化学研究表明，该物种富含喹唑啶类生物碱，特别是马亭类生物碱 [5,6,7]。这些化合物由于氧化 [8]、重排 [9, 10]、环开环 [11] 和二聚化 [12,13,14] 等多种生化修饰而表现出相当大的结构多样性。这些结构变化赋予了它们广泛的药理活性，包括抗炎 [15, 16]、抗病毒 [17]、抗菌 [3, 18, 19]、抗纤维化 [20] 和免疫调节 [21] 功能。尽管结构多样，但大多数马亭类生物碱都是完全饱和的并且富含sp3杂化，仅显示末端紫外吸收；相比之下，芳香性和高度修饰的马亭类衍生物较为罕见，虽然报道的类型较少，但由于其独特的骨架和有希望的生物活性而越来越受到关注 [7, 11]。炎症和细菌耐药性仍然是严重的全球健康问题 [22, 23]。过度的炎症反应会促进许多传染性和慢性疾病的进展，而抗菌素耐药性限制了现有抗生素的效果 [24, 25]。因此，联合疗法已成为提高抗菌疗效的重要方法。作为我们对Sophora flavescens生物碱活性成分持续研究的一部分 [7, 26]，我们分离出了六种罕见的芳香马亭类生物碱，命名为sophflarines F–K（图1）。化合物1和2是首次发现的含有4,5-二氢-3H-吡咯[2,3,4-ij]喹唑啉结构单元和芳香A/C环的nor-matrine衍生物，这与以前报道的主要涉及简单环裂解而无需大规模骨架重组的seco-或nor-matrine骨架明显不同。本文详细介绍了这些生物碱的分离过程、结构鉴定、可能的生物合成途径以及它们的抗炎和协同抗菌活性。

**2 结果与讨论**
2.1 分离和结构鉴定
总生物碱通过标准的酸碱提取法从Sophora flavescens根中制备。在对生物碱提取物进行初步分析时，几种成分在350 nm附近显示出紫外吸收带，这表明它们具有在马亭类生物碱中罕见的扩展共轭体系 [27]。这一诊断性光谱特征使得可以通过紫外引导的方法分离出化合物1–6。
化合物1以淡黄色晶体的形式分离出来，其光学旋转值可以忽略不计。紫外光谱显示出不寻常的共轭发色团吸收峰，峰值位于λmax 223, 237, 291, 和 352 nm。HRESIMS离子峰显示其分子式为C14H16N2O2（[M?+?H]+ 的质量数为245.1282，C14H17N2O2的质量数为245.1285），需要8个氢缺失指数（IHDs）。1H NMR谱显示了1,2-取代的吡啶环信号（δH 8.38 dd (6.5, 2.6), 8.24 dd (8.0, 2.6), 7.49 dd (8.0, 6.5)）以及多个sp3双键（δH 4.68 m, 3.00 m, 3.97 m, 2.38 m, 2.24 td (7.3, 2.5), 2.08 m）。13C NMR和DEPT数据显示，C14骨架归属于一个羧基碳（δC 180.0），七个芳香碳（δC 148.3, 137.0, 133.6, 131.2, 124.1, 115.6, 104.4）以及六个双键（δC 51.6, 36.8, 26.3, 25.4, 22.1, 17.5）（表1）。这些光谱数据结合生物合成推理表明，这是一种含有末端羧基侧链和独特芳香体系的nor-matrine衍生物，类似于flavesine G，后者也显示了D-环的断裂和芳香C环 [11]。通过H-2/H-3/H-4的1H-1H COSY自旋系统以及H2-8/H2-9/H2-10、H2-8到C-9/C-10/C-11、H2-10到C-2/C-6/C-8/C-9的多重HMBC相关性，确定了通过C-5???C-6???C-7连接的主体环结构单元（图2）。通过H2-12到C-7/C-11的关键HMBC相关性推断出C-11上的侧链。化合物1的二维结构通过X射线晶体数据得到验证，其空间群为C2/c（图3）。最终确定化合物1的化学结构是一种前所未有的马亭类骨架，包含15,16-seco环芳香化和17-nor结构修饰，命名为sophflarine F。

**2.2 结果与讨论**
2.2.1 分离和结构鉴定
总生物碱通过标准的酸碱提取法从Sophora flavescens根中制备。在对生物碱提取物进行初步分析时，几种成分在350 nm附近显示出紫外吸收带，这表明它们具有在马亭类生物碱中罕见的扩展共轭体系 [27]。这一诊断性光谱特征使得可以通过紫外引导的方法分离出化合物1–6。
化合物1以淡黄色晶体的形式分离出来，其光学旋转值可以忽略不计。紫外光谱显示出不寻常的共轭发色团吸收峰，峰值位于λmax 223, 237, 291, 和 352 nm。HRESIMS离子峰显示其分子式为C14H16N2O2（[M?+?H]+ 的质量数为245.1282，C14H17N2O2的质量数为245.1285），需要8个氢缺失指数（IHDs）。1H NMR谱显示了1,2-取代的吡啶环信号（δH 8.38 dd (6.5, 2.6), 8.24 dd (8.0, 2.6), 7.49 dd (8.0, 6.5）以及多个sp3双键（δH 4.68 m, 3.00 m, 3.97 m, 2.38 m, 2.24 td (7.3, 2.5), 2.08 m）。13C NMR和DEPT数据显示，C14骨架归属于一个羧基碳（δC 180.0），七个芳香碳（δC 148.3, 137.0, 133.6, 131.2, 124.1, 115.6, 104.4）以及六个双键（δC 51.6, 36.8, 26.3, 25.4, 22.1, 17.5）（表1）。这些光谱数据结合生物合成推理表明，这是一种含有末端羧基侧链和独特芳香体系的nor-matrine衍生物，类似于flavesine G，后者也显示了D-环的断裂和芳香C环 [11]。通过H-2/H-3/H-4的1H-1H COSY自旋系统以及H2-8/H2-9/H2-10、H2-8到C-9/C-10/C-11、H2-10到C-2/C-6/C-8/C-9的多重HMBC相关性，确定了通过C-5???C-6???C-7连接的主体环结构单元（图2）。通过H2-12到C-7/C-11的关键HMBC相关性推断出C-11上的侧链。化合物1的二维结构通过X射线晶体数据得到验证，其空间群为C2/c（图3）。最终确定化合物1的化学结构是一种前所未有的马亭类骨架，包含15,16-seco环芳香化和17-nor结构修饰，命名为sophflarine F。

**2.2.2 生物合成途径**
基于共分离的类似物，提出了化合物1–2和5的合理生物合成途径（见图1）。所有这些代谢物都可以追溯到sophoridine或matrine，这两种主要的喹唑啶类生物碱合计占粗生物碱组分的50%以上 [30]。在上方途径中，共分离的化合物3可能首先经历酸促成的类似 pinacol 的1,2-转移，生成重组中间体A1 [31]。随后的氧化和脱羧作用会产生中间体A2，后者可以通过羟基化进一步转化为A3 [32]。A3的脱水步骤形成了化合物1中观察到的特征性芳香C环体系。在下方途径中，flavesine G的氧化会产生相应的羧基中间体，经过脱水后形成γ-内酯骨架 [33]，从而生成化合物5。

**2.3 体内抗炎实验**
受先前实验结果的启发 [34, 35]，在硫酸铜诱导的斑马鱼炎症模型中评估了化合物1–6的体内抗炎活性（图5）。化合物1、4和5在非毒性浓度（50 μM）下表现出中等的抗炎效果，这从神经突触周围的荧光强度降低中得到体现。

**图5**
斑马鱼炎症模型中化合物1–6的抗炎效果。A. 用不同化合物处理的斑马鱼在CuSO4诱导的炎症模型中的代表性图像。B. 红色区域内中性粒细胞的定量分析。数据表示为三次独立实验的平均值±SEM。统计分析使用Student’s t检验进行。*P?2.3 与多粘菌素的协同抗菌活性
由mcr基因驱动的质粒介导的多粘菌素耐药性已成为治疗多重耐药革兰氏阴性菌感染的主要挑战，联合疗法被认为是一种恢复多粘菌素敏感性的有效策略 [23, 36, 37]。使用棋盘实验评估了多粘菌素与化合物1-6之间的协同效应，针对E. coli ATCC25922和BW25113-mcr-1（表4）。在E. coli ATCC25922中，化合物1、2、5和6显著增强了多粘菌素的敏感性，其MIC从4 μg·mL?1降至1和0.125 μg·mL?1（降低了4到32倍）。重要的是，化合物2、5和6还恢复了多粘菌素对mcr-1阳性菌株BW25113的活性，将其MIC降低了4到32倍，并产生了协同的FICI值。

表4 多粘菌素单独使用或与化合物1-6联合使用时的MIC和FIC值

3 实验
3.1 通用实验程序
结晶样品的熔点是在X-5数字微熔点仪器上测定的，未经校正。紫外光谱是使用JASCO V-550 UV/VIS分光光度计获得的，旋光度是在Autopol JASCO P-1020数字旋光计上测量的。红外光谱是使用KBr颗粒在JASCO FT/IR-480 Plus光谱仪上记录的。核磁共振（NMR）测量，包括1D和2D实验，是在Bruker Avance 600光谱仪上进行的（1H为600 MHz，13C为150 MHz），配备了标准的Bruker脉冲程序。化学位移（δ）以ppm表示，参考残留溶剂峰。高分辨率电喷雾离子化质谱（HR-ESI–MS）是使用Waters Synapt G2质谱仪获得的。单晶X射线衍射数据是在配备Cu-Kα辐射源（λ = 1.54178 ?）和CCD面积检测器的Agilent Gemini Ultra衍射仪上收集的。高效液相色谱（HPLC）分析是在配备PDA检测器的Shimadzu系统上进行的，使用分析或制备型的Waters XBridge RP18柱（洗脱剂为MeCN/H?O或MeOH/H?O）。薄层色谱（TLC）分析使用了氧化铝60 F2??基本板（Merck，中国）。本研究中使用的色谱材料包括D-101大孔树脂（Diaion，上海，中国）、中性氧化铝N（200–300 mesh；Aldrich，中国）、Sephadex LH-20（25–100 μm；Fluka，瑞士）、MCI CHP20P凝胶（75–150 μm；Sigma-Aldrich，中国）和ODS硅胶（50 μm；YMC，日本）。所有溶剂和试剂均为分析级，由中国商业供应商购买。

3.2 植物材料
S. flavescens Ait.的根材于2019年9月在中国陕西省西安市采集（34°46′–34°55′ N，109°08′–109°16′ E）。该材料的植物学鉴定由中国医药材料公司（广州）的资深草本专家Mai Zhengqiu先生验证。凭证标本（编号SF-201909）存放在华南农业大学兽医学院广东省重点兽医药物开发与安全评价实验室。

3.3 提取与分离
将S. flavescens的粉末根材（25公斤）用95% EtOH提取三次（每次48小时），合并提取物浓缩得到粗乙醇提取物（约3.5公斤）。将粗提取物悬浮在水中，然后用稀HCl酸化至pH 3–4，通过CHCl?提取去除中性成分。将剩余的水相碱化至pH 9–10，再用CHCl?提取，得到粗生物碱提取物（926克，提取系数：3.7%）。生物碱提取物在D-101大孔树脂柱上用分级EtOH–H?O混合物（10%–95%）进行色谱分离，得到五个组分，分别标记为Fr.1–Fr.5。Fr.1组分用水溶解并通过两次EtOAc分配去除亲脂性物质，水富集部分收集为Fr.1A（60.0克）。Fr.1A在中性Al?O?上使用CH?Cl?–MeOH（100:0?→?0:100，v/v，含1% Et?NH）进行色谱分离，得到七个亚组分，即Fr.1Aa–Fr.1Ag。其中，Fr.1Ag进一步在MCI CHP20P柱上用MeOH–H?O–NH?OH洗脱得到十六个组分（Fr.1Ag.1–Fr.1Ag.16）。组分Fr.1Ag.1–Fr.1Ag.5依次在Sephadex LH-20上用MeOH–H?O（1:1）进行色谱分离以富集次要生物碱。合并的洗脱液在ODS柱上用逐渐增加比例的MeOH–H?O（5%–50%）进行色谱分离，得到Fr.1Ag.1–5。最终纯化是在Waters XBridge? Phenyl柱上使用半制备型HPLC进行的，洗脱剂为MeOH/H?O或CH?CN/H?O（每种包含0.1% Et?NH；根据需要使用等度或浅梯度），得到化合物1（88.8毫克，tR = 9.7分钟）、2（0.9毫克，tR = 6.4分钟）、3（54.2毫克，tR = 16.1分钟）和4（33.9毫克，tR = 21.5分钟）。化合物5（7.0毫克，tR = 31.0分钟）和6（69.9毫克，tR = 19.0分钟）通过制备型RP-HPLC使用CH?CN/H?O/Et?NH（15:85:0.01，v/v/v）进行纯化。

3.4 分离物的光谱数据
Sophflarine F（1）：在CH3OH中呈淡黄色晶体；熔点128–129°C；[α]??D ± 0（c 0.01，CH3OH）；紫外光谱（CH3OH）λmax（log ε）223（3.17），237（3.02），291（2.66），352（2.61）nm；红外光谱（KBr）νmax 3412，3080，2937，2859，1561，1447，1389，1041 cm?1；1H NMR（600 MHz，CD3OD）和13C NMR（150 MHz，CD3OD），见表1；HRESIMS m/z 245.1282 [M?+?H]+（C14H17N2O2的calced值，245.1285）。
Sophflarine G（2）：呈淡黄色油状；[α]??D ± 0（c 0.01，CH3OH）；紫外光谱（CH3OH）λmax（log ε）200（3.17），223（2.92），290（2.71）和351（2.61）nm；红外光谱（KBr）νmax 3390，2931，2859，1593，1511，1415，1036 cm?1；1H NMR（600 MHz，CD3OD）和13C NMR（150 MHz，CD3OD），见表1；HR-ESI–MS m/z：261.1235 [M?+?H]+（C14H17N2O3的calced值，261.1234）。
Sophflarine H（3）：在CH3OH中呈无色晶体；熔点135–136°C；[α]??D ± 0（c 0.01，CH3OH）；紫外光谱（CH3OH）λmax（log ε）201（3.33）和359（2.91）nm；红外光谱（KBr）νmax 3423，2929，2857，1632，1451，1415，1331，1162 cm?1；1H NMR（600 MHz，CD3OD）和13C NMR（150 MHz，CD3OD），见表3；HR-ESI–MS m/z：279.1694 [M?+?H]+（C15H23N2O3的calced值，279.1703）；
（+）-Sophflarine H：白色无定形粉末；[α]??D 130.7（c 0.01，CH3OH）；ECD（CH3OH）λmax（Δε）233（??1.4），357（+?2.9）nm；
（?）-Sophflarine H：白色无定形粉末；[α]??D ?135.5（c 0.01，CH3OH）；ECD（CH3OH）λmax（Δε）233（??13.2），357（+?2.9）nm。
Sophflarine I（4）：棕色油状；[α]??D 3.3（c 0.01，CH3OH）；紫外光谱（CH3OH）λmax（log ε）200（3.18）和359（3.01）nm；ECD（CH3OH）λmax（Δε）233（??1.4），357（+?2.9）nm；红外光谱（KBr）νmax 3443，3287，2922，2854，1629，1470，1411，1330 cm?1；1H NMR（600 MHz，CD3OD）和13C NMR（150 MHz，CD3OD），见表3；HR-ESI–MS m/z：295.1642 [M?+?H]+（C15H23N2O4的calced值，295.1652）。
Sophflarine J（5）：呈淡黄色油状；[α]??D 6.3（c 0.01，CH3OH）；紫外光谱（CH3OH）λmax 200（3.13），308（2.68）nm；ECD（CH3OH）λmax（Δε）213（+?0.3），297（??3.7），340（+?1.7）nm；红外光谱（KBr）νmax 2933，2866，1625，1603，1444，1332 cm?1；1H NMR（600 MHz，CD3OD）和13C NMR（150 MHz，CD3OD），见表3；HR-ESI–MS m/z：259.1439 [M?+?H]+（C15H19N2O2的calced值，259.1441）。
Sophflarine K（6）：棕色油状；[α]??D ± 0（c 0.01，CH3OH）；紫外光谱（CH3OH）λmax 205，228，和296 nm；红外光谱（KBr）νmax 3443，3287，2922，2854，1629，1470，1451 cm?1；1H NMR（600 MHz，CD3OD）和13C NMR（150 MHz，CD3OD），见表3；HR-ESI–MS m/z：277.1520 [M?+?H]+（C15H21N2O3的calced值，277.1547）。

3.5 化合物1、3和6的X射线晶体学分析
化合物1、3和6的单晶X射线衍射分析是使用配备CCD面积检测器的Agilent Gemini Ultra衍射仪进行的，采用Cu Kα辐射（λ = 1.54184 ?）。结构确定是通过SHELXT程序的直接方法完成的，随后在Olex2平台上的SHELXL或SHELXS中使用全矩阵最小二乘法进行精细化。化合物1、3和6的晶体学信息文件（CIFs）已分别存放在剑桥晶体学数据中心（CCDC，https://www.ccdc.cam.ac.uk/）中，编号为2085308、2,358、218和2,358,219。使用SHELXP生成了晶体结构的ORTEP表示。晶体数据的总结和精细化参数如下：

Sophflarine F（1）的晶体数据：C14H20N2O4（M = 280.32 g/mol），单斜晶系，空间群C2/c（编号15），a = 50.0093(10) ?，b = 11.3394(2) ?，c = 14.5656(3) ?，β = 90.749(2)°，V = 8259.1(3) ?3，Z = 24，T = 149.99(10) K，μ(CuKα) = 0.823 mm?1，Dcalc = 1.353 g/cm3，测量了16,655个反射（7.072° ≤ 2Θ ≤ 147.84°），8107个唯一反射（Rint = 0.0247，Rsigma = 0.0310），所有计算均使用这些数据。最终R1为0.0754（I > 2σ(I)），wR2为0.1958（所有数据）。F2上的拟合优度为1.080。CCDC编号：2085308。
Sophflarine H（3）的晶体数据：C15H22N2O4（M = 258.30 g/mol）：单斜晶系，空间群P21/n（编号14），a = 8.340(2) ?，b = 14.179(4) ?，c = 12.361(3) ?，β = 98.75(3)°，V = 1444.8(7) ?3，Z = 4，T = 293(2) K，μ(CuKα) = 0.611 mm?1，Dcalc = 1.187 g/cm3，测量了5060个反射（9.556° ≤ 2Θ ≤ 151.168°），2839个唯一反射（Rint = 0.0519，Rsigma = 0.0601），所有计算均使用这些数据。最终R1为0.1255（I > 2σ(I)），wR2为0.3621（所有数据）。F2上的拟合优度为0.865。CCDC编号：2358218。
Sophflarine K（6）的晶体数据：C15H23N2O4.5（M = 303.35 g/mol）：三斜晶系，空间群P-1（编号2），a = 8.7462(8) ?，b = 11.2707(8) ?，c = 16.4281(11) ?，α = 81.481(6)°，β = 78.275(7)°，γ = 68.629(8)°，V = 1471.7(2) ?3，Z = 4，T = 293(2) K，μ(CuKα) = 0.836 mm?1，Dcalc = 1.369 g/cm3，测量了10,848个反射（5.512° ≤ 2Θ ≤ 147.798°），5777个唯一反射（Rint = 0.0433，Rsigma = 0.0562），所有计算均使用这些数据。最终R1为0.0958（I > 2σ(I)），wR2为0.2977（所有数据）。F2上的拟合优度为1.0