健康还是疾病——这是根际微生物生态学的问题吗？以葡萄树干病为例

《Plant and Soil》：Health or disease – a question of rhizomicrobial ecology? The case of grapevine trunk disease

　　目的：与葡萄藤干病（GTDs）相关的衰弱事件的发生率因气候变化而增加，这已成为全球葡萄种植面临的挑战。这些条件性疾病的爆发预计取决于根际微生物组。然而，根际微生物组对葡萄藤抗性的影响仍然知之甚少，特别是在其生态学方面。本研究探讨了GTDs、根际微生物组以及上莱茵河沿岸葡萄园土壤化学成分之间的联系。

方法：通过扩增子测序技术分析真菌和原核生物群落，我们发现大约一半的真菌根际群落具有致病潜力，这与植物的健康状况无关，其中包括17种先前报道的与GTDs相关的分类单元，主要是黑脚病。

结果：与真菌不同，细菌多样性会随着微量元素Fe、Cu、Mn和Zn的变化而变化。此外，无症状葡萄藤根际富集的分类单元，如真菌组的Pseudophialocephala和Collarina，以及细菌组的Caulobacter、Kitasatospora和Entotheonellaceae，与土壤性质相关。与疾病爆发最显著相关的特征是微生物共现网络的巨大变化。特别是在GTDs相关分类单元中，如Fomitoporia、Stereum、Phaeomoniella和Neofusicoccum，这些变化尤为明显。相比之下，在疾病爆发期间，许多细菌及其微生物相互作用会减少，如Isoptericola、Caulobacter、Rhodomicrobium和Thioprofundum。

结论：因此，可能是微生物相互作用而非仅仅是GTDs分类单元的存在导致了疾病爆发。这一发现为GTDs的可持续管理开辟了新策略。

引言：葡萄藤干病（GTDs）对全球葡萄种植构成威胁，而气候变化加速了这一趋势。仅在法国，2016年由于GTDs造成的产量损失就达到了25%，相当于大约50亿美元的经济损失（https://www.maladie-du-bois-vigne.fr）。GTDs包括一系列影响导管系统和木质部的疾病，如Botryosphaeria衰退病、Esca综合征、Eutypa衰退病、Diaporthe衰退病和黑脚病，并涉及多种真菌分类单元（Li等，2023a；Romanazzi等，2009）。已有多种属被报道为这些疾病的致病因子，因此GTDs不能归因于单一病原体，而是由具有不同流行病学特征和侵袭性的木材定殖真菌群落共同作用所致（综述见Guan等，2016；Kenfaoui等，2022；Fontaine等，2025）。与经典植物病害不同，GTDs不符合科赫假设。它们是条件性疾病，这意味着症状的表现与病原体数量无关，而是取决于宿主的状态。例如，当葡萄藤经历严重干旱胁迫时，侵袭性的Botryosphaeria衰退病病原体Neofusicoccum会从内生生活方式转变为坏死生活方式。这种转变与木质素前体阿魏酸的积累有关，阿魏酸作为一种“植物投降”信号，诱导病原体分泌毒力因子，触发宿主的程序性细胞死亡（Khattab等，2023）。在缺乏阿魏酸的情况下，病原体会通过分泌生长激素类似物4-羟基苯乙酸来干扰宿主的防御和生长平衡（Flubacher等，2023）。条件性致病性并非GTDs所独有。虽然植物-病原体相互作用常被概念化为宿主与病原体之间的斗争，但这种观点实际上简化了复杂的生态现实。事实上，这场斗争的结果取决于多种环境因素，包括其他可能强烈影响感染过程的存在微生物（Kwak等，2018）。作为固着生物，植物积极塑造其根际微生物群落，大量研究表明有益的土壤微生物能增强植物在生物和非生物胁迫下的生存能力（De Vries等，2020；Field等，2015；Ren等，2019）。这些观察支持了植物-根际微生物组相互作用由共同进化动态塑造的观点，且根际微生物组充当“第二基因组”，有助于植物健康和抗性（De Vries等，2020；Mendes等，2011）。因此，即使对于相同的宿主基因型和相似的土壤物理化学性质，疾病结果也可能从完全衰落到完全无症状持续存在不等，取决于根际微生物组的组成（Wei等，2019）。因此，根际微生物组的改变可以作为植物抗性或易感性的早期指标（Gu等，2022；Wei等，2019）。此外，实验证明富集保护性微生物群落可以抑制多种作物系统的疾病爆发（Lee等，2021）。这些发现表明，微生物相互作用而非个别分类单元可能是决定疾病爆发的关键因素。然而，在GTDs的背景下，根际微生物组的作用尚未得到充分研究。大多数研究集中在木质部组织中的真菌群落上，而地下微生物生态学仍很少被探索。少数研究指出，GTDs的爆发可能与根际Fusarium属的发生有关（Li等，2023a，b），或特定细菌分类单元的减少，例如Bacillaceae科成员（Fotios等，2021）。这些观察表明，GTDs的爆发可能是由根际微生物组的更广泛生态变化驱动的，而不仅仅是病原体的发生。土壤微生物组的组成和功能受到土壤物理化学性质的显著影响。例如，土壤酸化会降低微生物群落抑制真菌病原体（如Fusarium）的能力（Li等，2023a，b），而微量元素的可用性则调节微生物的丰富度、多样性和功能（Dai等，2023a，b）。大规模调查表明，铁、锰、铜和锌等金属微量元素是土壤微生物组结构的主要驱动因素。这些元素是参与呼吸作用、氧化还原反应和养分循环的微生物酶的重要辅助因子，可以直接影响微生物之间的竞争关系（Dai等，2023a，b）。特别是对于铁，实验证据表明，在铁限制条件下，根际微生物组可以通过铁载体介导的竞争抑制病原体，而当铁充足时这种抑制作用会消失（Gu等，2020）。在葡萄种植中，即使是微小的土壤性质和水分管理差异也会对产量和葡萄品质产生显著影响，这种现象传统上被称为“风土”。越来越多的证据表明，这些效应至少部分是由土壤和植物相关微生物组的改变介导的（Gilbert等，2014）。葡萄园土壤微生物组的分类组成和多样性受地理、管理实践和土壤化学性质的影响（Coller等，2019），并且土壤微生物群落可以作为与葡萄相关的微生物菌群的储存库（Zarraonaindia等，2015）。然而，土壤驱动的微生物组模式与GTDs爆发的关系仍大多未得到解决。葡萄藤根际微生物组、土壤性质和GTDs爆发之间的相互作用尚未得到系统研究。填补这一空白对于开发增强葡萄藤抗性的可持续策略至关重要，因为传统的育种方法速度慢且不足以应对快速变化的气候挑战。针对促进葡萄藤抗性的有益根际微生物群可能是一种快速且可持续的方法。本研究采用了一种微生物生态学策略，分析了来自同一葡萄园的有症状和无症状葡萄藤的根际微生物组，并采样了十个土壤成分不同的葡萄园。我们利用这种方法阐明了根际微生物组结构和土壤养分动态在葡萄藤对干病抗性中的作用。

本研究的主要问题是：GTDs的爆发是否仅由与GTDs相关的真菌驱动，还是可能与根际微生物组和微生物相互作用的更广泛变化有关。具体来说，我们测试了（i）GTDs相关真菌在有症状和无症状葡萄藤中是否表现出相似的水平，（ii）疾病爆发是否与特定微生物分类单元的减少或微生物共现网络的改变相关，以及（iii）土壤微量元素是否可以塑造葡萄园中根际微生物组的组成和多样性。了解这些微生物、养分和疾病症状之间的相互作用将有助于开发可持续的GTDs管理策略。

方法：
**根际土壤采样**：为了确定GTDs的爆发是否与根际微生物组成变化有关，2022年8月在德国上莱茵河沿岸选择了十个葡萄园进行采样，这些葡萄园位于巴登葡萄种植区的北部（Rauenberg）、中部（Ringsheim）和南部（Eichstetten、Ihringen）。其中八个地点种植了商业上重要的Müller-Thurgau品种，两个地点种植了传统的Silvaner品种（补充图1）。从表现出GTD症状或无症状的植物根毛区20厘米深的土壤中采集根际土壤。样本立即转移到干冰上，并在运输过程中保持低温，然后长期储存在-80°C。每个葡萄园提供六个根际土壤样本，三个来自有症状的植物，三个来自无症状的植物。

**DNA提取和扩增子测序**：按照制造商的说明，使用DNeasy PowerSoil Pro Kit（Qiagen，Hilden-Germany）从400毫克土壤样本中提取DNA。通过用10% v/v醋酸钠洗涤DNA去除酚类化合物，然后使用Qubit? 3.0荧光计（Thermo Fisher Scientific）和Qubit? dsDNA HS Assay Kit量化DNA浓度，并通过NanoDrop? 2000/2000c分光光度计（Thermo Fisher Scientific）进行质量评估。为了分析微生物群落的分类结构，使用10纳米的纯化DNA作为模板，扩增原核生物的16S核糖体RNA基因或真菌的内部转录间隔区（ITS）。对于16S rRNA，使用0.16微摩尔的引物对5’-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3’和5’-CCGTCAATTCCTTTGAGTTT-3’进行扩增，并与Illumina接头连接。对于ITS，使用相同的引物浓度5’-GCATCGATGAAGAACGCAGC-3’和5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’进行扩增。为了提高特异性，PCR在52–56°C进行退火。PCR后，使用0.04 U/μL的Q5高保真DNA聚合酶和Q5 High GC增强剂进行扩增步骤（Thermo Fisher）。随后使用DNA Clean & Concentrator Kit（Zymo research，Germany）清洗扩增子，然后用于准备扩增子测序文库。在这里，选择110纳米的清洁扩增子，使用0.4x和0.7×Agencourt Ampure XP珠子在两步中制备400–600 bp的片段大小（Beckman Coulter）。选择片段大小后，将扩增子与Illumina?的多重索引引物NEBNext? Multiplex Oligos（New England Biolabs，Frankfurt，Germany）连接，然后使用Ampure XP珠子进行清洁。制备好的文库被稀释、混合以达到等摩尔浓度，并在Illumina Novaseq平台上进行测序，每个样本生成150,000对末端读取（2×250 bp）（Novogene，Munich，Germany）。

**土壤化学分析**：每个葡萄园的6个土壤样本被合并成一个复合代表性样本。然后根据德国肥料法规（DüV）的要求，将土壤样本发送进行化学分析，包括土壤类型、pH值以及大量和微量元素的含量（Rhineland-Pfalz州的农业分析和研究机构，Speyer）。

**序列读取分析**：从Illumina测序仪获得的成对末端读取数据使用FASTQC工具（Andrews，2010）进行质量评估。去除低质量读取和Illumina接头，然后使用FASTP（Chen等，2018）合并快速q读取。合并的fastq读取数据进一步使用DADA2插件在QIIME2管道中去除嵌合读取和其他短于250 bp的读取数据（基于denoise-single方法（Bolyen等，2019）。然后将样本映射到相应的序列并计算频率，所得的操作分类单元（OTUs）使用Silva_99数据库（Robeson等，2021）对16S读取进行分类，或使用UNITE数据库（Abarenkov等，2024）对真菌ITS读取进行分类。真菌OTUs根据它们的营养模式使用FUNGuild数据库进行分类，该数据库根据真菌的营养模式（腐生、共生或致病）、相关宿主以及在病原体的情况下它们的首选定殖目标（木材、根或叶片）进行分类（Nguyen等，2016）。由于本研究或替代数据库中没有指定与GTDs相关的真菌分类单元，因此我们将之前报道为GTDs致病因子的木生分类单元（Li等，2023a；Martín等，2022）归类为GTDs社区。为了直观展示高复杂性，我们使用ComplexHeatmap软件和circlize工具基于相对频率构建了热图，并根据欧几里得距离对行和列的变体进行了聚类（Gu 2022）。为了识别与葡萄藤病害（GTDs）爆发相关的根际微生物群成员，我们使用R语言实现的微生物组组成分析及偏差校正工具（ANCOM-BC）来检测Müller-Thurgau葡萄园之间的潜在差异丰度。该工具旨在基于大小不同的样本推导出统计上一致的参数（Lin & Peddada 2020）。在这里，植物的健康状态（无症状与有症状）被设为感兴趣的协变量，而根据它们在GTDs中的角色对OTUs进行了评分。随后，将显著变化的OTUs在以植物健康状态为横轴的对数线性尺度上绘制出来，以显示对数倍数变化、检验统计量、标准误差、P值、调整后的P值以及差异丰度。

为了量化根际微生物群组成与土壤化学成分及GTDs爆发之间的差异，我们使用了多种参数。为了评估α多样性（特定地点的多样性），我们使用了Shannon指数作为总体估计（Shannon 1948）。为了考虑到由于抽样偏差可能导致稀有OTUs被低估的情况，我们还计算了Chao1指数（Chao 1987）和Faith系统发育多样性（Faith891PD）指数，后者也考虑了分类单元之间的系统发育关系（Faith 1992）。所有这些参数都是使用相应的QIIME2工具计算的。非参数Kruskal–Wallis检验用于测试土壤化学成分与GTDs症状之间的α多样性指数差异的统计显著性。

作为评估β多样性（即不同地点之间的差异）的另一种方法，我们进行了主坐标分析以检测各站点之间的共性。对于参数化，我们使用了R语言中的vegan包计算的Bray–Curtis距离（Oksanen等人，2024年），或者QIIME2中实现的Weighted-Unifrac距离。为了可视化结果，我们通过R语言的ggplot2插件使用了不同颜色的多边形，并设置了95%的置信水平。为了对葡萄园的化学成分进行分类，我们使用了R语言的FactoMinor和factoextra包进行了主成分分析。此外，我们还使用R语言的Hmisc和corrplot包计算并绘制了根际微生物群多样性指标与土壤化学成分之间的皮尔逊相关性（Harrell, 2024; Wei & Simko, 2021）。

通过计算共现网络来研究GTDs爆发期间根际微生物群动态和相互作用的变化，无论是对于无症状还是有症状的葡萄藤，都解析到了属级别。相关网络是使用R语言的phyloseq（McMurdie & Holmes, 2013）、microbiome（Lahti & Shetty, 2017）、Hmisc（Harrell, 2024）、igraph（Csardi & Nepusz, 2006）和ggplot2（Wickham, 2016）包进行评估和可视化的。真菌和原核生物群落网络是在属级别构建的。在排除未注释的OTUs后，使用Spearman相关系数确定了成对相关性，筛选标准为P<0.05表示统计显著性，|r|>0.6表示相关性强度。

土壤化学成分的差异反映在根际微生物群的差异上。对土壤化学性质的主成分分析（Suppl.Fig. 2a）显示了几种类型的化学成分。C、D、I和J葡萄园的土壤具有相似的化学特性。G和H葡萄园被单独分类，主要是因为它们的有机碳（C）、氮（N）和硼（B）含量较低，而F葡萄园则表现出相反的化学特征，这些元素的浓度较高。此外，E和B葡萄园因含有相对较高的Mn和K含量而被归为一组（Suppl.Fig. 2; Suppl.Fig. 3）。

关于根际微生物群结构，去除低质量和嵌合读段后，ITS扩增子共有8,893个特征的真菌操作分类单元（OTUs）。在门级别，各葡萄园之间的分类结构相对相似。最主要的真菌是子囊菌门（Ascomycota），其次是担子菌门（Basidiomycota）。此外，在F葡萄园中，Rozellomycota门更为普遍（Suppl.Fig. 2b）。在二十个最主要的真菌属中，有十七个属于子囊菌门。此外，Fusarium在所有葡萄园中最为丰富，占真菌总群的12-23%。根据最主要的真菌，Rauenberg葡萄园使用欧几里得距离被归为一组（Fig. 1a），这与土壤化学性质的PCA分析结果一致（Suppl.Fig. 2a）。这两个葡萄园的Fusarium相对丰度最低，但两种其他病原菌属Penicillium和Dactylonectria的丰度较高，同时有益真菌Solicoczzyma的存在也较高，已知这种真菌可以促进根系生长（Albornoz等人，2025年）。Eichstetten葡萄园还显示出另外两种真菌Fusidium和Subulicystidium的独特特征（Fig. 1a）。

土壤化学性质的主成分分析显示了几种类型的化学成分。C、D、I和J葡萄园的土壤具有相似的化学特性。G和H葡萄园被单独分类，主要是因为它们的有机碳（C）、氮（N）和硼（B）含量较低，而F葡萄园则表现出相反的化学特征，这些元素的浓度较高。此外，E和B葡萄园因含有相对较高的Mn和K含量而被归为一组（Suppl.Fig. 2; Suppl.Fig. 3）。

在根际微生物群结构方面，ITS扩增子去除低质量和嵌合读段后共有8,893个特征的真菌操作分类单元（OTUs）。在门级别，各葡萄园之间的分类结构相对相似。最主要的真菌是子囊菌门（Ascomycota），其次是担子菌门（Basidiomycota）。此外，在F葡萄园中，Rozellomycota门更为普遍（Suppl.Fig. 2b）。在二十个最主要的真菌属中，有十七个属于子囊菌门。此外，Fusarium在所有葡萄园中最为丰富，占真菌总群的12-23%。根据最主要的真菌，Rauenberg葡萄园使用欧几里得距离被归为一组（Fig. 1a），这与土壤化学性质的PCA分析结果一致（Suppl.Fig. 2a）。这两个葡萄园的Fusarium相对丰度最低，但两种其他病原菌属Penicillium和Dactylonectria的丰度较高，同时有益真菌Solicoczzyma的存在也较高，已知这种真菌可以促进根系生长（Albornoz等人，2025年）。Eichstetten葡萄园还显示出另外两种真菌Fusidium和Subulicystidium的独特特征（Fig. 1a）。

在Rauenberg葡萄园的根际微生物群中，木栖真菌占主导地位。使用FUNGuild数据库将定义的真菌OTUs注释到属级别。大约一半的真菌是病原菌（Fig. 2a）。其中大多数是机会性病原菌，否则它们作为腐生菌或共生菌存在，这表明它们的功能可能随宿主条件的不同而变化。相比之下，有益的菌类（非病原性且具有共生潜力）的丰度较低，占比从2.9%到7.4%不等（Fig. 2a）。作为另一种方法，我们调查了包括根据Li等人（2023a）和Martín等人（2022）分类的木栖菌类的相对丰度。在采样区域的南部，即Iringen和Ringsheim（E、I、C）葡萄园中，木栖病原菌的发病率最高（84-94%），而在北部的Rauenberg（A和B）葡萄园中，木栖病原菌的比例较低，占木栖菌群的68-74%。相比之下，Rauenberg葡萄园显示出了非病原性腐生菌的最高丰度（Fig. 2b）。

在根际微生物群中，定义的真菌OTUs使用FUNGuild数据库注释到属级别。大约一半的真菌是病原菌（Fig. 2a）。其中大多数是机会性病原菌，否则它们作为腐生菌或共生菌存在，这表明它们的功能可能取决于宿主的条件。相比之下，有益的菌类（非病原性且具有共生潜力）的丰度较低，占比从2.9%到7.4%不等（Fig. 2a）。作为另一种方法，我们调查了包括根据Li等人（2023a）和Martín等人（2022）分类的木栖菌类的相对丰度。在采样区域的南部，即Iringen和Ringsheim（E、I、C）葡萄园中，发现木栖病原菌的发病率最高（84-94%），而在北部的Rauenberg（A和B）葡萄园中，木栖病原菌的比例较低，占木栖菌群的68-74%。相比之下，Rauenberg葡萄园显示出了非病原性腐生菌的最高丰度（Fig. 2b）。

在根际微生物群中，木栖真菌占主导地位。使用FUNGuild数据库根据营养方式对ITS序列进行了注释（a）：b）根据16S rRNA基因序列对顶级20个原核菌类进行了注释。每个葡萄园由六个根际样本代表。行根据每个OTU的分类门进行颜色编码，而列根据每个葡萄园的地理来源进行颜色编码。16S扩增子的嵌合读段率较高，大约有30%的读段被过滤掉。在超过60个复杂土壤样本的原核菌群中处理这样的嵌合读段会限制输出结果，并可能引入16S扩增谱型的偏差。在复杂的微生物群中，例如肠道微生物群和土壤中，先前也有类似的伪影比例报告（Reitmeier等人2021；Straub等人2020）。此外，我们研究中16S rRNA基因的V3–V4区域的扩增也可能导致嵌合体的形成，因为V3–V4区域之间的保守区域会增加PCR过程中的错误引物化频率。在去噪步骤之后，16S读段代表了84,221个原核菌类OTUs。在这里，根际的原核菌群显著丰富，其OTU数量是真菌群的10倍。在物种级别，识别出了1566个真菌群的扩增子序列变异体（ASVs）和2786个原核菌类来源的ASVs。在原核生物中，放线菌门（Actinomycetota）是主导细菌门，形成了整个葡萄园的根细菌群。其次分别是假单胞菌门（Pseudomonadota）、绿弯菌门（Chloroflexota）和酸杆菌门（Acidobacteriota）（Suppl.Fig. 2c）。在古菌群方面（总体上只占很小一部分），Crenarchaeota在B和F葡萄园中更为丰富。此外，对葡萄园根际微生物群中二十个最主要的细菌属进行分析后发现，其中十四个属于放线菌门。尽管如此，总体上最主导的属是来自绿弯菌门的KD4-96（Fig. 1b），其次是Nocardioides（Fig. 1b）。值得注意的是，Iringen的两个葡萄园（I和F）显示出独特的长菌群特征，以Tepidiforma和Rokubacteriales的较高丰度为特点，而J葡萄园特别显示出了Kribbella的显著富集。

在根际微生物群中，定义的真菌OTUs使用FUNGuild数据库注释到属级别。大约一半的真菌是病原菌（Fig. 2a）。其中大多数是机会性病原菌，否则它们作为腐生菌或共生菌存在，这表明它们的功能可能取决于宿主的条件。相比之下，有益的菌类（非病原性且具有共生潜力）的丰度较低，占比从2.9%到7.4%不等（Fig. 2a）。作为另一种方法，我们调查了包括根据Li等人（2023a）和Martín等人（2022）分类的木栖菌类的相对丰度。在采样区域的南部，即Iringen和Ringsheim（E、I、C）葡萄园中，发现木栖病原菌的发病率最高（84-94%），而在北部的Rauenberg（A和B）葡萄园中，木栖病原菌的比例较低，占木栖菌群的68-74%。相比之下，Rauenberg葡萄园显示出了非病原性腐生菌的最高丰度（Fig. 2b）。我们观察到特定真菌类群与土壤化学特性的显著关联。例如，担子菌门（Basidiomycota）与微量元素铁（Fe）、铜（Cu）和锌（Zn）呈正相关，但与碳酸钙（CaCO?）和pH值（碱度）呈负相关。同样，罗泽尔菌门（Rozellomycota）与有机碳（Org_C）和氮（N）呈正相关，也与微量元素硼（B）相关。总体而言，在疾病爆发期间数量减少的类群似乎对土壤中的微量元素更为敏感。在这里，Collarina类群在土壤性质方面的变化最大，它与锌（Zn）、铜（Cu）、锰（Mn）、铁（Fe）和碳氮比（C.N ratio）呈正相关，其次是g_Pseudophialocephala类群，其与锌（Zn）、铜（Cu）、铁（Fe）、锰（Mn）和钾（K）也有显著相关性。此外，Cistella类群也与铁（Fe）水平有关。

图4显示了根际微生物群组成与土壤物理化学参数之间的相关性。a) 木腐真菌、主要真菌门以及不同丰度的真菌类群（在三十株有症状的葡萄藤和三十株无症状的葡萄藤之间）与测量土壤参数之间的皮尔逊（Pearson）相关模式。b) 主要细菌门和类群与有症状葡萄藤相关的负相关模式，以及与土壤变量的关系。星号（*、**和***）分别表示ANOVA P值≤0.05、≤0.01和≤0.001。

**原核生物的变化**：在有症状的葡萄藤中，许多细菌的操作分类单元（OTU）的数量显著下降（图3b）。在与健康葡萄藤相关的类群中，放线菌门（Actinomycetota）和假单胞菌门（Pseudomonadota）各有五个OTU数量减少。受影响最大的类群是Isoptericola、Thioprofundum、Caulobacter、Rhodomicrobium以及来自拟杆菌门（p_Bacteroidota）的Chryseolinea。其他门只有一个OTU数量减少。例如，在拟杆菌门（p_Bacillota）中，只有一个OTU（Xylanivirga）数量减少，在肠杆菌门（p_Entotheonellaeota，属于Entotheonellaceae科）中也是如此。另一方面，也有几个根际细菌组（rhizobacteriome）成员在有症状的葡萄藤中显著增加：拟杆菌门（p_Bacteroidota）中的Puia和Ferruginibacter增加最多，还有四个来自假单胞菌门（Pseudomonadota）的OTU，以及来自疣微菌门（Verrucomicrobiota）、p_Patescibacteria和粘球菌门（Myxococcota）的各一个OTU显著增加。

我们寻找了与这些细菌数量变化以及特定原核生物门优势相关的土壤化学性质（图4b）。通常最占优势的细菌门——放线菌门（p_Actinomycetota）仅与碳酸钙（CaCO?）呈负相关，而假单胞菌门（p_Pseudomonadota）与磷（P）、钾（K）和锌（Zn）呈负相关。酸杆菌门（p_Acidobacteriota）与硼（B）呈正相关，古菌门（p_Crenarchaeota）与铜（Cu）呈正相关。土壤性质也对与葡萄藤灰霉病（GTDs）无症状阶段相关的几个类群有显著影响。具体来说，Caulobacter类群与碳氮比（C.N ratio）、镁（Mg）、铁（Fe）、铜（Cu）和锌（Zn）呈正相关，但与碳酸钙（CaCO3）呈负相关（图4b）。与Caulobacter类似，肠杆菌科（Entotheonellaceae）也根据碳氮比（C.N ratio）、铁（Fe）和碳酸钙（CaCO3）的增加而丰富，但在碱性pH环境下数量减少。

**根际微生物共现网络的变化与葡萄藤健康状况的关系**：为了评估不同根际微生物类群之间的相互作用和关系是否受到葡萄藤健康状况的影响，我们推断了有症状葡萄藤和无症状葡萄藤中的真菌（图5a,b）和原核生物（图5d,e）微生物组的共现网络。在这里，真菌和原核生物的共现网络变化在质上是不同的。在健康葡萄藤中检测到1680个显著相关性，而在葡萄藤灰霉病爆发期间增加到1856个显著相关性（图5g）。这种增加的一个显著特点是，与疾病相关的类群与其他真菌类群之间的相关性在葡萄藤转为有症状阶段时翻了一番（补充表1；图5c）。大多数葡萄藤灰霉病相关类群的相关性特征发生了剧烈变化。例如，Fomitiporia在疾病爆发期间显示了十三个显著相关性，而在无症状植物中则没有。同样，Stereum的相关性增加了八倍。此外，这种真菌还扩大了与其他葡萄藤灰霉病相关类群（如Phaeomoniella和Fomitiporia）以及其他六种木腐真菌和病原菌类群的相关性（补充表1）。同样，在有症状的葡萄藤中，Phaeomoniella显示了29个相关性，而不仅在Fomitiporia上，还在其他十一个病原菌类群上。具有Botryosphaeria衰退病的侵袭性属Neofusicoccum在疾病爆发期间显示出15个不同的相关性，而在无症状阶段只有8个相关性。对于与Diaporthe相关的衰退病，只有在与Paurocotylis的显著相关性在有症状的葡萄藤中观察到（补充表1）。另一个例子是Coprinellus，它在有症状的葡萄藤中更为普遍（图3a）。这种真菌在无症状葡萄藤中与Keissleriella相关，但在葡萄藤灰霉病爆发条件下与Tulasnella形成了显著相关性。

图5显示了葡萄园中根际微生物共现网络的变化与葡萄藤健康状况的关系。分别构建了与无症状（a, d）和受葡萄藤灰霉病影响（b, e）葡萄藤相关的真菌（a, b）和原核生物（d, e）社区的共现网络。网络是使用Spearman相关性推断的，并过滤了统计显著性（p<0.05）和相关强度（|r|>0.6）。每个节点代表一个操作分类单元（OTU），节点的大小代表正向成对关联的数量，每条边代表OTU之间的显著正向相关性。在真菌网络中，与葡萄藤灰霉病相关的类群按疾病类型进行颜色编码，而非葡萄藤灰霉病相关的类群显示为灰色。原核生物节点根据六个最占优势的细菌门进行颜色编码。在原核生物网络中标记的OTU表示在葡萄藤灰霉病爆发期间显著减少的类群。c) 无症状与有症状葡萄藤根际中与葡萄藤灰霉病相关的真菌类群的显著成对相关性数量，颜色代码反映了葡萄藤灰霉病的类型。f) 在葡萄园根际中，葡萄藤灰霉病爆发期间根际微生物组中负向变化的细菌类群的显著成对相关性数量。g) 基于健康状况的葡萄园根际中真菌和原核生物社区的显著成对相关性总数。

与真菌相比，1167个原核生物属的连通性从健康葡萄藤的11,856个显著相关性急剧下降到葡萄藤灰霉病爆发期间的6,361个显著相关性（图5g；补充表2）。在这里，与无症状阶段相关的类群与其他土壤原核生物的相互作用特征不同。例如，肠杆菌科（Entotheonellaceae）在健康葡萄藤的根际中是一个核心节点，有六个强烈的成对相关性，但在葡萄藤灰霉病爆发后变成了一个边缘节点，只有两个相关性。此外，Isoptericola类群失去了它们的相关性，甚至从共现网络中消失，而Thioprofundum、Kitasatospora、Rhodomirobium、Methylothermalis、Illumatobacter和Caulobacter在有症状植物中失去了与其他细菌的正面相关性（图5f；补充表2）。只有少数类群显示出相反的模式：Steroidobacter和Chryseolinea仅在有症状的葡萄藤中建立了更多的正向相关性。

**细菌多样性与土壤和真菌生物多样性的关系**：作为生态系统稳定性的标志，我们确定了不同葡萄园中根际微生物组的多样性指标，这些葡萄园在土壤参数和地理位置上有所不同，无论是在无症状植物中还是在疾病爆发期间。评估了不同葡萄园中葡萄藤根际微生物组的细菌和真菌多样性指标，这些葡萄园在土壤性质、地理位置和疾病状态上存在差异。总体而言，α-多样性和β-多样性指标没有显示出与葡萄藤灰霉病爆发一致的变化（补充图5）。只观察到葡萄园特定的效应：葡萄园E和G中的细菌Shannon多样性有显著差异，而葡萄园D和F中的真菌β-多样性（Bray–Curtis）在无症状和有症状葡萄藤之间有差异。在不同葡萄园中，α-多样性指标（Shannon和Chao1）基本保持稳定，且与宏观或微量元素水平没有显著相关性，这表明仅依赖于类群丰富度和均匀性的指标对环境变化的敏感性相对较低（图6；补充图6）。

**不同地理位置和土壤化学性质下真菌（a）和原核生物（b）社区的β-多样性指标变化**：基于加权-Unifrac距离或Bray–Curtis距离，对不同葡萄园土壤的真菌和原核生物社区进行主成分分析（PCOA1, PCOA2）。每个地理位置的β-多样性指标（Eichstetten, Ihringen, Ringsheim, Walldorf）被分为不同颜色的多边形。为了统计上评估远处多边形的显著性，“β-多样性指标每位置”使用了ggplot包的stat_ellipse函数，设置为0.95的水平。计算了真菌（c）和原核生物（d）社区的多样性指标与土壤化学参数变化（如土壤化学性质的主成分分析（PC1, PC2）和微量元素浓度）的相关性。相关性图的颜色代码表示相关系数的值，显著性水平=0.05；绿色表示显著的正相关系数；橙色表示显著的负相关系数，而空色表示不显著的相关系数。

相比之下，结合系统发育关系的多样性指标显示了明显的模式。Faith的系统发育多样性（PD）是最变异的α-多样性指标，并与土壤化学特性有强烈关联，特别是在原核生物社区中，PD与铁（Fe）、铜（Cu）和锌（Zn）呈正相关（图6d）。同样，包含分类学距离的β-多样性指标显著增加。在这里，加权UniFrac捕捉了30%的方差，而使用Bray–Curtis仅捕捉了4%。真菌β-多样性因地理位置而显著不同，北部地区的葡萄园（Rauenberg和Ringsheim）与南部地区的葡萄园（Eichstetten）明显分开。这种空间结构在很大程度上独立于土壤性质，其中碳酸钙（CaCO?）是唯一显示出显著关联的土壤参数（图6a, b）。相比之下，原核生物社区组成与土壤性质更紧密相关，铁（Fe）、锌（Zn）和铜（Cu）一致解释了系统发育和非系统发育的β-多样性模式（图6；补充图6）。这些结果共同表明，细菌多样性主要由土壤化学决定，而真菌社区结构更受地理环境的影响，系统发育指标对于揭示这些关系至关重要。

**讨论**：本研究探讨了葡萄藤干病（GTDs）的爆发与上莱茵河谷南北走向采样十个葡萄园中的根际微生物组组成和动态之间的关系。通过比较葡萄园内有症状和无症状葡萄藤，我们发现葡萄藤灰霉病相关真菌从潜伏阶段到坏死阶段的转变伴随着真菌和原核生物根际微生物组的分类转变。使用多种多样性指标和相关性网络分析，我们检测到原核生物社区组成与土壤化学性质的强关联，而真菌类群主要受宿主状态和地理环境的影响。这些发现提出了三个核心问题，指导了接下来的讨论：（i）为什么原核生物社区主要对土壤化学做出反应，而真菌社区没有显示出类似的丰度变化？（ii）什么机制可能导致特定原核生物类群与葡萄藤健康状况的关联？（iii）改变的真菌相关网络对我们理解葡萄藤灰霉病的发病机制意味着什么？

**土壤生态学：真菌通过代谢状态响应，细菌通过增殖响应**（H1, H3）：根际微生物组在维持植物健康和抵抗环境挑战方面发挥着核心作用（Berendsen等人2012；Gu等人2022）。因此，了解土壤生态如何塑造微生物社区组成和功能对于可持续的葡萄栽培至关重要。我们的分析揭示了两个显著特征。对于真菌社区来说，宿主状态而非土壤性质似乎决定了疾病爆发。葡萄园根际的主要真菌门是子囊菌门（Ascomycota）和担子菌门（Basidiomycota）（补充图1），这与先前跨品种和不同地理区域的葡萄园研究一致（Bao等人2022；Berlanas等人2019；Coller等人2019；Lailheugue等人2024）。此外，在葡萄园之间没有观察到共生或病原性真菌类群的显著差异（图2a）。大约50%的检测到的真菌类群具有多营养型潜力，支持这样的情景：疾病爆发并不是由病原体数量的增加定义的，而是由真菌行为的变化定义的。这种条件性的发病机制已在Neofusicoccum parvum中得到验证，其中向坏死性的转变是由宿主产生的代谢信号触发的（Khattab等人，2023；Flubacher等人2023）。鉴于大多数真菌次级代谢物基因簇在未受到特定环境线索激活时保持沉默（Brakhage & Schroekh, 2011），土壤生态的差异可能反映在真菌代谢状态的变化上，而不是丰度的变化上。

相比之下，原核生物社区受到地理和土壤化学的强烈影响。放线菌门（Actinomycetota）主导了细菌根际微生物组，其次是假单胞菌门（Pseudomonadota）、绿弯菌门（Chloroflexota）和酸杆菌门（Acidobacteriota）（补充图2c），这种模式在欧洲和中国的不同葡萄园中都有报道，尽管存在强烈的区域差异（Bao等人2022；Berlanas等人2019；Coller等人2019；Lailheugue等人2024；Marasco等人2018）。在不同研究之间的这种比较需要谨慎对待，因为采样时间也可能影响根际微生物组的结构（Berlanas等人，2019年）。然而，对于当前研究的数据，由于样本是在8月采集的，因此可以排除季节性差异的影响。我们的数据表明，细菌丰度模式的差异主要来源于土壤性质，而不是疾病状态。这一点通过伪单胞菌门（Pseudomonadota）与锌（Zn）、钾（K）和磷（P）之间的相关性，以及酸杆菌门（Acidobacteriota）与硼（B）和氮含量之间的相关性得到了支持（图4b）。更普遍的是，系统发育多样性指标（Faith_PD、UniFrac）与铁（Fe）、铜（Cu）、锰（Mn）和锌（Zn）等微量营养素之间的强关联性表明，微量营养素的可用性是细菌群落形成的关键驱动因素（图6c）。这些元素在微生物代谢、呼吸作用、氧化还原反应和养分循环中起着核心作用（Dubinsky等人，2010年；Whalen等人，2018年；Dai等人，2023a年）。此外，调控土壤中磷代谢的基因的丰度与锰含量有很强的相关性（Shepherd & Oliverio，2024年），这支持了一个观点，即细菌主要通过改变其繁殖能力和群落组成来响应环境变化。

与真菌不同，真菌可以通过激活沉默的代谢模块来响应环境信号，而细菌依赖于重组代谢上紧密关联的菌群（Pascual-García等人，2020年）。简而言之，真菌群落主要通过代谢可塑性来响应土壤生态，而细菌群落则通过丰度和组成的变化来响应。

葡萄藤溃疡病（GTD）的爆发与有益细菌类群的丧失和微生物网络连通性的降低有关。在疾病爆发期间，我们观察到细菌群落组成发生了显著变化，这在共现网络中表现得最为明显。网络节点之间正相关性的显著减少表明，在疾病爆发期间，根际微生物组的连通性和功能稳定性受到了影响（图5g）。Isoptericola、Thioprofundum、Caulobacter、Rhodomicrobium和Chryseolinea等类群的持续减少表明它们与稳定的、与健康相关的根际微生物组结构有关（图3b）。涉及Isoptericola等类群的正面相互作用的消失进一步支持了一个解释，即疾病爆发反映了有益微生物相互作用的破坏，而不是新优势类群的出现（图5e；补充表2）。可能的原因是养分竞争加剧、功能下降，或者是与疾病爆发相关的细菌群落的兴起。

鉴于大约一半的真菌根际微生物组具有致病潜力（图2a），细菌网络的减少或不稳定可能会促进条件性真菌病原体向致病性的转变。虽然葡萄藤中的根本机制尚未明确，但在其他作物中的研究表明，健康植物的根分泌物可以促进增强养分循环和植物免疫力的根际微生物组（Chen等人，2024年；Du等人，2024年；Wilhelm等人，2023年）。在GTD爆发前的严重胁迫条件下（Khattab等人，2023年），改变的根分泌物模式可能会破坏已建立的微生物网络，导致有益类群的丧失和致病性生活方式的促进。

这些发现表明，稳定与健康相关的细菌网络可能是可持续管理GTD的一种策略。补充微量营养素可能有助于实现这一目标，因为微量营养素与系统发育多样性指标以及与健康相关的细菌的较高丰度有很强的相关性（图4；图6）。尽管从相关性数据中无法推断出因果关系，但鉴定出的细菌类群代表了功能测试的有希望的候选者。实际上，之前已有研究表明，与放线菌门（Actinomycetota）和杆菌门（Bacillota）的共接种可以减缓GTD的进展（Cobos等人，2022年），无论是通过直接拮抗作用还是通过激活宿主防御反应（álvarez-Pérez等人，2017年；Haidar等人，2016年；Trotel-Aziz等人，2019年）。

与灰霉病（Downy Mildew）或白粉病（Powdery Mildew）等其他葡萄病害不同，GTD的发病机制远未明了。传统上，如果某种病原体是症状出现的必要和充分条件，则将其确定为病原体，这种方法被称为科赫法则（Koch Postulates，Loeffler，1884年）。然而，这种方法适用于GTD是不准确的，因为症状很少能简单地归因于特定真菌的存在或缺失。这导致了一个具有争议性的观点，即Esca病可能并不是一种传统的真菌病害（Hofstetter等人，2012年），而是一种生态综合征，其中真菌是在其他胁迫因素损害植物后造成的。与此观点一致的是，大多数与GTD相关的类群，在有症状和无症状的葡萄藤之间没有显示出显著的丰度变化（图2c）。Coprinellus似乎是唯一的例外，但有证据表明它可能是一种腐生性的“搭便车者”，在疾病爆发后依赖腐烂组织生存，而不是疾病的驱动因素（Brown等人，2020年；Cui等人，2024年）。相比之下，疾病爆发后真菌群落内的相互作用动态发生了显著变化。具有致病潜力的GTD相关类群之间的相互关联性显著增加，特别是在Esca相关的真菌如Phaeomoniella与Fomitiporia、Stereum与Fomitiporia以及Stereum与Phaeomoniella之间（补充表1）。这些模式支持了一个模型，即一旦宿主抵抗力受损，真菌类群会通过共殖民或代谢上的互惠作用进行合作。这些相互作用的变化是由有益细菌的丧失、根分泌物改变还是直接胁迫信号触发的，还有待通过实验来验证。尽管如此，真菌相互作用网络的增强显然支持了一个由生态因素驱动的GTD发病机制模型，这一模型超越了单纯考虑病原体发生率的观点。

展望：将GTD视为一种基于假设的生态疾病模型。总的来说，我们的结果提供了一个连贯的、基于假设的模型，用于理解GTD作为植物-微生物-环境相互作用的结果。数据支持这样的假设：GTD的爆发并不是由于与GTD相关的真菌数量增加，而是由于微生物群落和相互作用的重组。细菌根际微生物组结构与土壤中微量营养素的可用性有很强的关联，而疾病爆发的特征是有益细菌类群的丧失和网络连通性的降低。同时，真菌群落主要通过相互作用动态的变化来响应，而不是丰度的变化。尽管这项研究是相关性的，并且仅代表了疾病爆发期间的静态快照，但它识别出了与所提出假设明显相关的统计上稳健的关联。未来的工作需要结合时间采样和功能测定来确定因果关系，特别是关于微生物对植物免疫的驱动因素和真菌生活方式的转变。尽管如此，目前的发现为开发基于根际微生物组的策略提供了坚实的概念基础，以增强葡萄藤的抵抗力，并补充现有的GTD管理方法。