《Lab on a Chip》：Bacterial extracellular vesicles indirectly destabilize a human stem cell-derived blood–brain barrier on-chip through pro-inflammatory stimulation of immune cells
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本期推荐：针对既往血脑屏障（BBB）体外模型缺乏免疫细胞组分导致细菌胞外囊泡（BEVs）作用机制研究受限的问题，研究人员利用微生理系统硅膜平台（μSiM）构建人诱导多能干细胞源脑微血管内皮样细胞（BMECs）与周细胞共培养的血脑屏障芯片模型，发现BEVs虽可上调BMECs表面细胞间黏附分子-1（ICAM-1），但无法直接破坏紧密连接蛋白或增加小分子染料通透性；而经BEVs刺激的THP-1巨噬细胞分泌的条件培养基则可显著破坏BMECs紧密连接并升高屏障通透性。该研究强调了在BEVs介导的血脑屏障损伤研究中纳入免疫细胞组分的重要性，为脓毒症相关神经炎症的机制探索与干预策略开发提供了更具生理相关性的体外模型。
脓毒症是一种由感染引发的过度炎症反应导致的致命性器官功能障碍，也是医院内死亡的主要原因之一。当细菌或其他病原体入侵时，免疫系统会释放大量促炎信号，引发“细胞因子风暴”，导致发热和宿主细胞死亡。这种失调的宿主反应往往比入侵的病原体更具破坏性，会造成组织和器官的自身损伤。其中，大脑血管的内皮功能障碍尤为危险，因为这会破坏保护中枢神经系统的血脑屏障（Blood–Brain Barrier, BBB）。
血脑屏障是血管与脑实质之间的界面，它通过尺寸、化学和电荷选择性，阻止破坏性分子和细胞进入，同时允许氧气和必需营养物质的交换。脑微血管内皮细胞是执行这一神经保护作用的主要细胞，它们通过紧密连接蛋白（如闭锁小带蛋白-1、Claudin-5和Occludin）形成物理屏障，限制细胞旁扩散。此外，周细胞作为血管壁周围的细胞，不仅通过收缩调节血流，还能通过与内皮细胞的通讯增强屏障特性。然而，在脓毒症期间，促炎细胞因子会导致内皮紧密连接破坏，增加屏障通透性，并上调内皮细胞表面的细胞间黏附分子-1（Intercellular Adhesion Molecule-1, ICAM-1），从而招募循环中的白细胞。这些白细胞一旦结合内皮细胞，就会跨内皮迁移进入大脑，激活驻留的小胶质细胞，引发神经炎症，导致谵妄甚至长期的神经系统疾病。
细菌胞外囊泡（Bacterial Extracellular Vesicles, BEVs）是细菌脂质膜衍生的纳米颗粒，携带信号因子、核酸、脂多糖（Lipopolysaccharide, LPS）和其他毒素，是脓毒症发病的重要介质。既往研究表明，BEVs可以直接破坏内皮紧密连接，增加细胞旁通透性，这可能是其进入大脑加剧神经炎症的机制之一。然而，这些研究多在简化的体外模型中进行，缺乏关键的免疫细胞组分，无法模拟体内复杂的相互作用。因此，本研究旨在探究大肠杆菌来源的BEVs是直接破坏血脑屏障芯片模型的完整性，还是需要免疫细胞组分的参与，从而为更精准地模拟BEVs介导的血脑屏障损伤提供证据。该研究成果发表在《Lab on a Chip》期刊上。
为开展此项研究，研究人员采用了多个关键技术方法：首先构建了基于超薄多孔氮化硅膜的微生理系统（Microphysiological System enabled by a Silicon Membrane, μSiM）芯片平台，用于模拟血脑屏障；其次，利用同基因的人诱导多能干细胞（Human Induced Pluripotent Stem Cell, hiPSC）分别分化为脑微血管内皮样细胞（Brain Microvascular Endothelial-like Cells, BMECs）和脑周细胞样细胞（Brain Pericyte-like Cells, BPLCs），并在μSiM芯片上共培养形成血脑屏障模型；第三，从大肠杆菌CFT073菌株中分离纯化BEVs，并通过纳米颗粒跟踪分析（Nanoparticle Tracking Analysis, NTA）、透射电子显微镜（Transmission Electron Microscope, TEM）和Western Blot等技术对其表征；第四，利用人白血病单核细胞系THP-1诱导分化为未极化巨噬细胞（M0），并用BEVs或LPS刺激后收集条件培养基；最后，通过免疫荧光染色检测ICAM-1和紧密连接蛋白Claudin-5的表达，利用荧光黄（Lucifer Yellow）渗透实验评估屏障通透性，并通过多重细胞因子检测技术分析条件培养基中的促炎因子水平。
研究结果如下：
The μSiM supports a physiological BPB co-culture model
μSiM芯片成功支持生理相关的BMEC-周细胞共培养屏障（BMEC-Pericyte Barrier, BPB）模型构建。免疫染色显示，共培养模型中BMECs位于BPLCs上方，符合血管壁的生理结构。与BMEC单培养相比，共培养模型能沉积更多的胶原蛋白IV、层粘连蛋白和纤连蛋白，证实周细胞有助于基底膜的产生，这与既往研究结果一致。
LPS and BEVs upregulate BMEC expression of ICAM-1
从大肠杆菌CFT073菌株分离的BEVs具有典型的形态和尺寸特征，平均直径为164.0±1.1 nm，浓度为7.41×1011±2.53×1010particles ml-1，且每个BEV含有0.69±0.01 fg LPS。在含2%胎牛血清（提供LPS结合蛋白LBP）的培养基中，无论是纯LPS还是BEVs处理，均能显著上调BMECs表面的ICAM-1表达，且去除血清会消除BEVs诱导的ICAM-1上调。
Neither LPS nor BEVs disrupt the BMEC barrier at the assayed treatment times and concentrations
在测试的剂量和时间点下，LPS或BEVs处理并未引起BMECs紧密连接蛋白Claudin-5荧光的显著变化，也未显著增加荧光黄（457 Da）的屏障通透性。相比之下，作为阳性对照的促炎“细胞因子混合物”（cytomix，由等量肿瘤坏死因子α、白细胞介素-1β和干扰素γ组成）则能显著降低Claudin-5染色并升高屏障通透性，证实模型对炎症刺激具有反应性。
THP-1 macrophages are responsive to BEVs
THP-1细胞经佛波酯诱导分化为M0巨噬细胞后，对BEVs表现出剂量和时间依赖性的ICAM-1上调反应。活力实验显示，BMEC单层在含50%未处理THP-1条件培养基的混合培养基中能保持完整，但当条件培养基浓度升至75%或100%时，会出现间隙，因此后续实验采用50%的条件培养基稀释比例。
Conditioned medium from BEV-treated THP-1 macrophages disrupts the BMEC barrier
经1×108BEVs ml-1处理24小时的THP-1巨噬细胞收集的条件培养基，能显著上调BMECs的ICAM-1表达。在μSiM共培养模型中，该条件培养基导致Claudin-5表达出现明显间隙，并使荧光黄通透性从5.68×10-4±2.01×10-4cm min-1显著升高至9.59×10-4±2.71×10-4cm min-1。细胞因子分析显示，BEVs处理的THP-1巨噬细胞分泌的促炎因子（如TNF-α、IL-1β、IL-1RA、IL-2、IL-8、GM-CSF、MCP-1和IL-6）水平显著升高，这可能是导致血脑屏障破坏的原因。
研究结论与讨论部分强调，BEVs是脓毒症发生和持续的重要介质，但既往研究多忽略了免疫细胞在其中的作用。本研究发现，尽管BEVs和LPS能直接上调BMECs的ICAM-1（可作为内皮细胞反应性的标志物），但在生理相关剂量下无法直接破坏屏障功能；而BEVs通过刺激巨噬细胞释放促炎细胞因子，间接导致了血脑屏障的破坏。这一结果表明，在体外研究BEVs对血脑屏障的影响时，必须纳入免疫细胞组分，才能更准确地预测其在人体内的作用。该研究构建的μSiM-BPB模型整合了BEVs、血脑屏障和免疫细胞相互作用，为脓毒症相关神经炎症的机制研究和潜在治疗干预策略的开发提供了更具生理相关性的平台。未来的研究可进一步纳入星形胶质细胞，或在流动条件下探索单核细胞与BEVs刺激的血管内皮细胞的相互作用，以更全面地模拟体内的病理过程。
