《Lab on a Chip》：An automated modular microfluidic platform for end-to-end mRNA synthesis and purification
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为解决传统mRNA生产过程中手工、分批的下游操作效率低、耗时长的瓶颈，研究人员开发了一种端到端的自动化模块化芯片实验室平台。该平台将振荡式体外转录（Os(IVT)）与新型微流控消化/澄清（μFD）单元、以及基于实时pH/电导反馈的多模式色谱（MMC）模块相集成。结果表明，该集成工作流程在2小时内完成了合成到纯化的全过程，单次运行产出1275±1.7 μg mRNA，相较于完全分批的基准工艺产量提升约2.0倍，同时双链RNA（dsRNA）杂质减少了83.3%。该工作将振荡式微流控IVT从一个独立的强化反应器发展为闭环、端到端的微流控制造平台，为快速、可重复地生产高质量mRNA提供了实用路径。
mRNA疗法，特别是基于mRNA的疫苗，已经为现代医学带来了革命性变化，并在传染病防控等领域展现出巨大潜力。然而，要将mRNA更广泛地应用于癌症免疫治疗等其他治疗领域，其生产制造过程仍面临严峻挑战。当前，传统的体外转录（IVT）反应存在混合不均、传热不佳等问题，容易导致RNA聚合酶失活和产量降低。更棘手的是，下游的纯化处理步骤通常复杂、耗时且依赖于大量人工操作，涉及去除未掺入的核苷酸、残留DNA模板、酶、异常转录本以及具有免疫原性的双链RNA（dsRNA）污染物等。这些步骤不仅成本高昂，还可能导致产物损失和mRNA完整性受损。因此，开发高效、自动化且可集成的mRNA生产平台，以满足对RNA生物制剂日益增长的需求，已成为一项紧迫任务。
为了解决上述瓶颈，研究人员在《Lab on a Chip》上报道了一种由中央计算机控制的模块化微流控平台，实现了从合成到纯化的端到端mRNA自动化生产。该研究基于此前已建立的用于强化转录的振荡式微流控IVT模块（Os(IVT)），核心创新在于将其与下游处理单元无缝集成。
研究人员主要运用了以下几项关键技术方法：1. 振荡式微流控体外转录（Os(IVT）：利用PTFE蛇形微混合器产生振荡流，在毛细管反应器中进行mRNA合成，通过在线光谱仪反馈控制流动反转，实现强化混合与精确的停留时间控制。2. 微流控消化/澄清（μFD）模块：开发了一种集成生物催化膜与微切向流过滤（μ-TFF）的装置。将DNase I共价固定在聚多巴胺（Pdop）功能化的聚醚砜（PES）膜上，形成生物催化膜，用于在连续流动中快速降解并去除DNA模板，同时通过过滤去除小分子杂质。3. 自动化多模式色谱（MMC）纯化：采用Python脚本控制的自动化系统，驱动多阀注射泵，并集成实时pH和电导率传感器。纯化步骤（平衡、上样、洗涤、洗脱）的转换由传感器反馈的事件驱动逻辑控制，而非固定计时，提高了纯化的重现性和分辨率。4. 集成平台运行与控制：通过一个集中式的监控与数据采集（SCADA）/制造执行系统（MES）层（用Python实现），对整个工作流程（Os(IVT) -> μFD -> MMC -> 中空纤维切向流过滤(HF-TFF)）进行统一编排和自动化控制，实现模块间的无缝衔接和封闭、无菌的流路操作。
开发自动化集成微流控平台
研究构建的平台包含四个按序排列的自动化单元操作：用于mRNA合成的Os(IVT)、用于DNase I介导的模板去除和切向流过滤的μFD模块、带有在线pH和电导监测的自动化MMC模块，以及用于脱盐和浓缩的中空纤维切向流过滤（HF-TFF）模块。这种模块化设计为后续的逐模块评估和集成运行提供了框架。
振荡式微流控流动IVT：单元操作A
Os(IVT)生物反应器作为集成平台的单元操作A运行。在优化条件下（微混合器流速1 mL min-1，毛细管流速100 μL min-1，停留时间60分钟），Os(IVT)过程在1小时内产生了3310 ng μL-1的萤火虫荧光素酶（FLuc） mRNA，相较于1小时分批工艺（955 ng μL-1）产量提高了346%。此前研究已表明，Os(IVT)衍生的mRNA在相同下游测定条件下，其蛋白表达量比4小时分批基准高151%，dsRNA含量低65%。
开发微流控消化（μFD）模块
为了简化下游处理，研究用一步式μFD模块取代了传统的分批式DNase I消化加TFF。该模块将DNase I固定在PES生物催化膜上，并与连续微流控TFF（μ-TFF）单元结合，实现了在连续流动形式下同步进行DNA模板消化和杂质预去除。使用30 nm孔径的PES-Pdop-DNase I生物催化膜，在总流速100 μL min-1下循环3个周期（总时间<5分钟），即可实现DNA模板的完全消化和去除，同时保留全长mRNA。该膜在连续五次运行中保持了98%的初始消化效率，显示出优异的可重复使用性。
用于mRNA纯化的自动化多模式色谱（MMC）模块
在μFD模块处理后，通过自动化MMC步骤进行纯化，选择性捕获并回收全长mRNA。该过程由Python脚本控制器协调，其步骤转换由实时pH和电导率传感器反馈驱动，仅当测量值进入预定义目标范围并保持稳定时才进行下一步。这种闭环、传感器驱动的方法增强了短mRNA物种和残留T7 RNA聚合酶的清除能力，提高了运行间的重现性。在优化条件下，洗脱部分的mRNA回收率达到约93.3%。
离散/连续模块化工艺的比较评估
研究通过比较不同工作流程的mRNA产量和纯度，验证了各模块的效率。完全分批工作流程（B(IVT) + BD + OdT）产生了641 ± 0.6 μg FLuc mRNA。而将OdT替换为MMC后，产量提高到870 ± 2 μg。采用Os(IVT)的离散流程（Os(IVT) + BD + OdT）将产量提升至773 ± 0.6 μg。将Os(IVT)与MMC结合（Os(IVT) + BD + MMC），产量几乎翻倍，达到1241 ± 1.2 μg。最后，用μFD模块替代BD的离散流程（Os(IVT) + μFD + MMC）实现了最高产量（1283 ± 1.3 μg）和最高纯度（A260/230= 2.27）。这些结果表明，Os(IVT)、μFD和MMC序列的每个步骤都对提高产量和纯度有明确贡献，为全自动化连续mRNA生产平台奠定了基础。
自动化微流控平台的集成mRNA合成与纯化
基于上述离散流程的优异性能，研究开发了完全集成的微流控平台[Os(IVT)–μFD–MMC]。该平台通过集中式的SCADA/MES控制层，将Os(IVT)、μFD、自动化MMC和最终的HF-TFF模块串联起来，实现了准连续处理。集成工作流程一致性地生产出高产（1275 ± 1.7 μg）、高纯度（A260/230= 2.26）的mRNA，产量与离散流程相当。平台还成功适应了不同的DNA模板（如pGEM）和核苷酸化学组成（如N1-甲基-假UTP (M1)和N6-甲基-ATP (M2)），展现了其通用性。
不同工艺间的mRNA完整性与杂质分析
转录本完整性与序列长度：毛细管电泳（CE）和变性琼脂糖凝胶电泳（AGE）分析表明，集成工作流程产生的mRNA显示出单一的、尖锐的全长转录本峰（约1960个核苷酸），而分批工作流程则显示出与截短或异常转录本对应的次级峰，表明集成平台能更好地保持mRNA完整性。
双链RNA杂质的定量：通过J2单克隆抗体ELISA和斑点杂交检测发现，分批衍生的mRNA中dsRNA含量为8-12 ng μg-1mRNA，而集成微流控工艺 consistently 将dsRNA水平降至3 ng μg-1mRNA以下，相对于分批工艺减少了83.3%。
残留T7 RNA聚合酶的检测：ELISA检测表明，分批和集成工作流程在MMC步骤后均能有效消除残留的T7 RNA聚合酶，其水平低于检测阈值，符合监管纯度标准。
集成mRNA生产平台的性能评估
集成平台将端到端处理时间从常规分批工作流程的约6小时缩短至约2小时。单次运行可生产1275 ± 1.7 μg mRNA，这相对于完全分批基准（B(IVT) + BD + OdT）的641 ± 0.6 μg，产量提升了约2.0倍。时间缩短主要归因于：μFD模块在<5分钟内完成模板消化和澄清；MMC采用传感器门控步骤转换，避免了固定、过长的等待；以及封闭流路消除了模块间手动转移的延迟。该集成设计支持通过增加单元操作数量（numbering-up）进行直接扩展，其模块化架构、封闭无菌流路以及对不同模板/核苷酸的适应性，为其应用于分散式或快速响应制造奠定了基础。
研究结论与意义
本研究成功报道了一个由计算机集中控制的模块化微流控平台，它集成了mRNA端到端合成与纯化的关键单元操作。该集成[Os(IVT)–μFD–MMC]工作流程在2小时内完成了从合成到纯化的全过程，单次运行产出约1.2毫克高质量mRNA，产量相比完全分批工艺提升约2.0倍，同时双链RNA杂质减少了83.3%，MRNA回收率达到约93.3%。平台生产的mRNA转录本完整性好，蛋白表达功能增强，并且能够适应不同的基因模板和化学修饰核苷酸。
这项研究的重要意义在于，它将振荡式微流控IVT从一个独立的强化反应器，发展成为一个自动化、端到端的芯片实验室工作流程。该平台通过集成酶处理、基于过滤的预处理以及传感器引导的色谱纯化，显著减少了人工操作，提高了过程的重现性和效率。其紧凑的模块化设计为通过延长运行时间或增加单元操作数量来实现规模化生产提供了实用基础。这项工作为在需要快速、灵活和降低操作依赖性的场景中，进行可重复、高质量mRNA生产指明了一条切实可行的路径，尤其适用于爆发疫情应对和个性化治疗应用。
