《Journal of Biological Chemistry》：PRSS23 promotes ovarian cancer peritoneal dissemination independent of protease activity
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本刊推荐：卵巢癌腹膜播散是致死主因，其过程需肿瘤细胞抵抗失巢凋亡（anoikis）并在腹腔中再增殖。研究者通过临床数据分析锁定S1丝氨酸蛋白酶家族成员PRSS23，并通过体外、体内实验证实PRSS23在高级别浆液性（HGSOC）和透明细胞（OCCC）卵巢癌中均促进增殖、抵抗anoikis、驱动腹膜种植；进一步揭示PRSS23虽分泌为成熟蛋白酶结构域，却缺乏经典Ile16-Asp194激活开关，且其促肿瘤表型不依赖蛋白酶活性，提示PRSS23可能是一种丝氨酸假蛋白酶（serine pseudoprotease）。该发现为卵巢癌腹膜转移提供了新的机制视角与潜在干预靶点。
卵巢癌是致死率最高的妇科恶性肿瘤，其中高级别浆液性卵巢癌（HGSOC）和卵巢透明细胞癌（OCCC）是两种尤为棘手的亚型。卵巢癌的转移有其独特途径——腹膜播散：肿瘤细胞从原发灶脱落，进入充满腹水的腹腔环境，必须以单细胞或细胞团的形式悬浮存活，抵抗一种名为“失巢凋亡”（anoikis）的细胞死亡程序，随后成功种植在腹膜等间皮表面并重新增殖。这一系列步骤构成了复发和治疗失败的关键环节。腹腔内的恶性腹水富含各种生长因子、细胞因子和蛋白酶，形成了一个复杂的微环境，其中S1家族丝氨酸蛋白酶因其在细胞外基质重塑、生长因子激活和信号传导中的潜在作用而备受关注。然而，这个庞大的蛋白酶家族中，哪些成员真正驱动了卵巢癌的恶性进展，其具体机制又是什么，仍是未解之谜。为此，Sharoon Akhtar、Matt Coban等研究者开展了一项系统研究，旨在从临床关联出发，鉴定关键的S1蛋白酶，并深入揭示其在卵巢癌腹膜播散中的功能和机制。相关成果发表在《Journal of Biological Chemistry》。
研究者运用了多项关键技术来推进这项研究。首先，他们利用公共数据库（如KMplotter平台）对卵巢癌患者队列进行了生物信息学分析，以生存期为指标筛选与不良预后相关的S1丝氨酸蛋白酶基因。在细胞和分子层面，研究采用短发夹RNA（shRNA）介导的基因敲低、定量逆转录聚合酶链反应（qRT-PCR）、蛋白质印迹法（Western blot）和活性探针标记等技术，在代表性HGSOC和OCCC细胞系中验证靶基因功能。在动物模型中，研究者建立了腹腔移植瘤模型，结合生物发光成像技术，纵向监测肿瘤生长和播散。此外，通过RNA测序（RNA-seq）和基因集富集分析（GSEA）解析了基因敲低后的转录组变化。在生化机制探索中，研究者运用CRISPR/Cas9基因编辑构建内源性标签细胞系，通过免疫沉淀-质谱联用（IP-MS/MS）鉴定分泌蛋白，并利用重组蛋白酶结构域进行了底物活性测定。
研究结果
多个S1丝氨酸蛋白酶基因的表达与卵巢癌不良生存相关。
研究者从MEROPS数据库筛选了113个人类S1蛋白酶域对应的基因，并对其中93个在卵巢癌队列中进行了生存分析。发现32个基因的高表达与更差的总生存期（OS）相关（风险比HR>1），其中15个具有统计学显著性。关联性最强的八个基因中，HTRA3、TMPRSS12和 PRSS23位列前三，其高表达均预示着更差的OS、无进展生存期（PFS）和无进展后生存期（PPS）。已知与卵巢癌转移相关的尿激酶型纤溶酶原激活物（uPA，由PLAU基因编码）也位列其中，为该方法提供了内部验证。
HTRA3敲低显示亚型依赖性的增殖和失巢凋亡效应。
在卵巢癌细胞系中检测发现，TMPRSS12转录本极低，而 HTRA3和 PRSS23有稳定表达。随后在HGSOC和OCCC细胞系中敲低 HTRA3基因。结果显示，在HGSOC细胞（OVCAR-3, Caov-3）中，HTRA3敲低显著抑制了细胞增殖；而在OCCC细胞（JHOC-8, TOV-21G）中，增殖抑制效应微弱。在低附着条件下（模拟悬浮状态），HTRA3敲低仅在OCCC细胞中引起了轻微但显著的失巢凋亡增加。这些结果表明 HTRA3对卵巢癌细胞的影响具有组织学亚型依赖性。
PRSS23敲低降低增殖并增强跨卵巢癌亚型的失巢凋亡敏感性。
相比之下，PRSS23的敲低在HGSOC（OVCAR-3, OVCA-420）和OCCC（JHOC-5, OVCA429）细胞系中均产生了显著且一致的表型：细胞增殖能力大幅下降，同时在悬浮状态下对失巢凋亡的敏感性显著增强。这表明PRSS23在促进增殖和抵抗失巢凋亡这两个腹膜播散的关键环节中，扮演了跨越亚型的重要角色。
PRSS23敲低限制腹腔移植瘤模型中的肿瘤建立、播散和腹水形成。
为了在体内验证PRSS23的功能，研究者将对照或敲低 PRSS23的卵巢癌细胞（OVCA-420和JHOC-5）注射到小鼠腹腔。通过生物发光成像长期监测发现，与对照组相比，PRSS23敲低组的肿瘤信号增长显著减缓，表明肿瘤在腹腔内的生存和生长能力受损。终点解剖时，PRSS23敲低组小鼠腹腔内多个器官的肿瘤负荷显著降低。在JHOC-5 OCCC模型中，所有对照组小鼠都产生了恶性腹水，而所有敲低组小鼠均未出现腹水。这些结果强有力地证明PRSS23是卵巢癌腹膜播散的关键驱动因子。
PRSS23敲低重编程了炎症、黏附和细胞周期转录网络。
为了探究PRSS23发挥作用的分子机制，研究者对敲低PRSS23的细胞进行了RNA测序分析。基因集富集分析显示，在HGSOC和OCCC细胞中，PRSS23的缺失导致了一个共同的转录程序改变：与细胞周期、DNA修复相关的基因表达下调；而与炎症反应、TNFα（肿瘤坏死因子α）信号、IL-6（白细胞介素-6）-JAK-STAT3信号以及上皮-间质转化（EMT）/细胞黏附相关的基因表达上调。这为PRSS23促进增殖和抵抗失巢凋亡的表型提供了分子层面的解释。
PRSS23以前体形式合成，并被分泌为糖基化的丝氨酸蛋白酶同源域。
通过CRISPR/Cas9在内源性PRSS23基因C端引入标签，研究者发现PRSS23在细胞内以前体形式（约46 kDa）存在，而在条件培养基中则以一个更小的、糖基化的片段（约36 kDa）形式分泌。质谱分析证实，分泌的片段完全来源于蛋白酶结构域，其N端起始于一个预测的弗林蛋白酶（furin）切割位点（RRKR）下游。这表明PRSS23经历前体加工，其成熟的蛋白酶结构域被分泌到细胞外。
重组PRSS23蛋白酶域未检测到Ser316依赖的肽酶活性，且缺乏经典的S1家族激活开关。
尽管AlphaFold结构预测显示PRSS23蛋白酶域具有完整的催化三联体（Ser316-His175-Asp246），但重组表达的PRSS23蛋白酶域在一系列发色底物检测中均未显示出依赖于催化丝氨酸（Ser316）的蛋白水解活性。序列比对和结构分析揭示了关键原因：PRSS23缺乏经典的S1蛋白酶“Ile16-Asp194”激活开关。在活性蛋白酶中，切割产生的新N端Ile16会与Asp194形成盐桥，稳定活性构象。而PRSS23在相应位置是Gln和Ala，无法形成此关键相互作用，这从结构上解释了其催化活性的缺失。
PRSS23通过蛋白酶非依赖性机制促进卵巢癌细胞的失巢凋亡抵抗和增殖。
活性探针标记实验进一步证实，从卵巢癌细胞分泌的PRSS23蛋白无法被广谱丝氨酸水解酶活性探针标记，表明其在生理环境下也不具备可检测的丝氨酸水解酶活性。最关键的是，当研究者将内源性PRSS23标签细胞系中的催化丝氨酸Ser316突变为丙氨酸（S316A）后，该突变体蛋白依然能支持细胞增殖，并且敲低PRSS23在突变背景细胞中引起的增殖抑制和失巢凋亡敏感性增强效应，与在野生型背景细胞中完全一致。这确凿地证明，PRSS23的促肿瘤功能完全不依赖于其假定的蛋白酶催化活性。
研究结论与意义
本研究通过临床数据驱动的筛选，将PRSS23鉴定为卵巢癌腹膜播散的关键调节因子。功能实验表明，PRSS23能同时促进卵巢癌细胞的增殖和抵抗失巢凋亡，并在小鼠模型中驱动腹腔内肿瘤的形成和播散。尽管PRSS23被分泌为成熟的丝氨酸蛋白酶同源域，并保留了催化三联体，但深入的生化分析和突变实验证实，它缺乏可检测的蛋白水解酶活性，其促肿瘤功能也完全不依赖于催化丝氨酸。序列和结构分析揭示了其失活的根本原因：PRSS23缺失了S1蛋白酶家族经典的“Ile16-Asp194”激活开关，这使其无法形成催化活性所必需的构象。
因此，本研究的核心结论是：PRSS23以一种蛋白酶非依赖性的方式发挥功能，促进卵巢癌的腹膜播散。研究者提出，PRSS23应被重新归类为一种丝氨酸假蛋白酶。假蛋白酶是一类保留了酶蛋白折叠结构但失去催化活性的蛋白质，它们通常通过蛋白质-蛋白质相互作用发挥类似配体、支架或调节因子的功能。PRSS23可能作为细胞外信号分子，通过结合未知的受体或复合物，激活下游促生存、促增殖的信号通路（如抑制炎症应激、维持细胞周期进程），这与其敲低后观察到的转录组变化相符。
这项研究具有多重重要意义。在基础科学层面，它拓宽了对S1蛋白酶家族功能的认识，强调在癌症研究中需超越“蛋白酶中心”视角，关注假蛋白酶的非催化功能。在转化医学层面，由于PRSS13是分泌蛋白，且与不良预后强相关，它有望成为卵巢癌（特别是腹膜转移）的新型生物标志物或治疗靶点。针对其分泌、或与其受体相互作用的干预策略，可能为遏制致命的卵巢癌腹膜播散提供新的思路。
