肥大细胞稳态依赖皮肤成纤维细胞和血管周围细胞的KIT配体支持

《Journal of Investigative Dermatology》：Mast cell homeostasis depends on KIT ligand from dermal fibroblasts and perivascular cells in mouse skin

针对皮肤肥大细胞（MC）稳态维持的细胞来源争议，本研究通过KitlGFP/+报告小鼠结合单细胞测序，系统绘制小鼠耳部皮肤KITLG表达图谱，并利用六种条件性基因敲除模型证实：生理状态下角质形成细胞来源的KITLG对真皮MC存活非必需，而真皮成纤维细胞与血管周围细胞才是维持MC稳态的关键KITLG来源，为皮肤免疫微环境调控提供了新视角。

　　

在人体的皮肤深处，驻扎着一群神秘的“哨兵”——肥大细胞（Mast Cells, MCs）。它们是免疫系统的重要成员，平时默默守护在组织间隙，一旦遇到过敏原或病原体，就会迅速释放组胺等“武器”，引发炎症反应甚至过敏反应。然而，这些哨兵并非无根之木，它们的生存和驻守依赖于一种关键的“粮草”——KIT配体（KIT Ligand, KITLG，也称为干细胞因子SCF）。长期以来，科学界一直困惑：在复杂的皮肤组织中，究竟是哪种细胞在为这些肥大细胞源源不断地提供生存所需的KITLG？是表皮的角质形成细胞，还是真皮层中的各种基质细胞？这个看似基础的问题，却直接关系到我们对皮肤免疫稳态乃至过敏性疾病机制的理解。

为了解决这一争议，由Tim L?mmermann等研究者组成的团队在《Journal of Investigative Dermatology》发表了一项突破性研究。他们利用先进的基因工程小鼠模型和单细胞测序技术，像侦探一样精准地追踪了皮肤中KITLG的来源，最终颠覆了以往的认知，为真皮肥大细胞的稳态维持绘制了一幅全新的“供养地图”。

为了精准解答这个问题，研究人员采用了多管齐下的策略。他们首先利用Kitl^GFP/+基因敲入小鼠作为报告系统，通过免疫荧光成像直观观察KITLG在皮肤中的表达位置。接着，他们对从耳部皮肤分选出的GFP阳性细胞进行了单细胞RNA测序（scRNA-seq），在转录组水平详细描绘了KITLG表达细胞的种类和特征。最关键的是，研究团队构建了多达六种条件性基因敲除小鼠模型，分别靶向删除内皮细胞、角质形成细胞、平滑肌细胞以及不同亚群的成纤维细胞中的Kitl基因，从而在活体动物中验证不同细胞类型对肥大细胞稳态的贡献。

Kitl在小鼠耳皮肤多种基质细胞类型中表达

研究人员首先对Kitl^GFP/+小鼠的耳皮肤全组织进行免疫荧光染色。结果显示，KITLG不仅表达于既往报道的血管平滑肌细胞（VSMCs，ACTA2⁺）和内皮细胞（ECs，CD31⁺），还广泛存在于PDGFRA/B阳性的真皮成纤维细胞中。相比之下，真皮巨噬细胞并不表达Kitl。这种广泛的表达模式导致杂合的Kitl^GFP/+小鼠（半剂量不足）已经出现了肥大细胞数量的显著减少，提示KITLG的剂量效应对肥大细胞存活至关重要。

内皮细胞来源的KITLG对肥大细胞稳态作用有限

为了评估内皮细胞的贡献，研究者构建了Tek-Cre^+/-Kitl^fl/fl（Kitl^Δendo）小鼠。虽然PCR验证了内皮细胞中Kitl基因的高效切除，但在稳态成年小鼠的皮肤中，无论是耳部还是背部皮肤，内皮细胞特异性敲除并未导致肥大细胞数量的显著下降（背部皮肤雌性有轻微下降，雄性无差异）。然而，在血管极其丰富的舌头组织中，内皮细胞敲除却导致了明显的肥大细胞减少。这表明，在稳态皮肤的低血管密度环境下，内皮细胞来源的KITLG对于维持肥大细胞并非必需，但在高血管化的非皮肤组织中则扮演重要角色。

成纤维细胞是小鼠耳皮肤主要的KITLG表达基质细胞类型

通过scRNA-seq对Kitl^GFP/+小鼠耳皮肤中CD31阴性、GFP阳性的细胞进行分析，研究人员鉴定出了11个不同的细胞簇。除了血管平滑肌细胞和周细胞外，大部分KITLG表达细胞属于成纤维细胞谱系。其中，两个主要的耳部成纤维细胞群（EarFib1和EarFib2）高表达Kitl。相反，基底角质形成细胞和施万细胞中几乎检测不到Kitl转录本。这一数据强烈暗示，成纤维细胞才是皮肤中KITLG的主要生产者。

角质形成细胞来源的KITLG在稳态皮肤中对肥大细胞稳态非必需

针对既往研究中关于角质形成细胞作用的矛盾结论，研究者利用K14-Cre^+/-Kitl^fl/fl（Kitl^Δker）小鼠进行了验证。尽管这些小鼠因表皮黑素细胞缺失而表现出白毛症状，且PCR证实了角质形成细胞中Kitl的有效删除，但与野生型对照相比，其耳部和背部皮肤的真皮肥大细胞数量完全正常。此外，Kitl^Δker小鼠的耳部皮肤仍保留色素沉着，说明真皮下方的黑素细胞也未受影响。这一结果表明，在稳态未受挑战的皮肤中，角质形成细胞来源的KITLG对于真皮肥大细胞的维持是可有可无的，其主要作用局限于支持表皮黑素细胞的存活。

Myh11表达细胞贡献KITLG以支持真皮肥大细胞稳态

考虑到部分肥大细胞位于血管周围，研究者利用Myh11-ERT2Cre^+/-Kitl^fl/fl（Kitl^ΔSMC）小鼠，在成年期诱导性删除血管平滑肌细胞和周细胞中的Kitl。结果发现，敲除四周后，耳部皮肤肥大细胞减少了约27%，背部皮肤减少了约38%。这首次揭示了Myh11⁺的血管周围细胞也是维持真皮肥大细胞稳态的重要KITLG来源。

基质细胞KITLG水平和空间分布控制肥大细胞稳态

为了进一步确认成纤维细胞的作用，研究者分析了Pdgfra-Cre^+/-Kitl^+/fl（Kitl^ΔPdgfra-het）小鼠。由于Pdgfra在多种间充质细胞（包括成纤维细胞）中广泛表达，这些小鼠表现出显著的肥大细胞减少。若构建纯合敲除的Kitl^ΔPdgfra小鼠，则会导致严重的发育障碍和完全的真皮肥大细胞缺失。此外，利用Prrx1-Cre^+/-Kitl^fl/fl（Kitl^ΔPrrx1）小鼠进行的区域特异性研究显示，肥大细胞的减少严格局限于Cre重组酶阳性的区域（如耳朵和四肢），而在Cre阴性的背部皮肤则不受影响。相关性分析更是发现，局部Cre活性越强（即Kitl删除越彻底），该区域的肥大细胞数量就越少，完美印证了KITLG供应的空间局限性。

Pdgfrb⁺成纤维细胞是成年小鼠皮肤重要的KITLG提供者

最后，研究者利用他莫昔芬诱导的PdgfrbERT2-Cre^+/-Kitl^fl/fl（Kitl^ΔPdgfrb）模型，靶向删除成年小鼠中PDGFRB⁺的成纤维细胞和血管周围细胞。结果显示，敲除四周后，耳部皮肤肥大细胞锐减约70%，背部皮肤减少约63-66%。剩余的肥大细胞体积变小、形态变圆，呈现出粘附功能受损的特征。相比于仅靶向血管周围细胞的Kitl^ΔSMC模型，靶向成纤维细胞的Kitl^ΔPdgfrb模型造成的肥大细胞缺失更为严重，确立了Pdgfrb⁺成纤维细胞在维持肥大细胞稳态中的主导地位。

综上所述，这项研究通过精细的细胞谱系追踪和功能缺失实验，彻底厘清了小鼠皮肤中维持肥大细胞稳态的KITLG来源。研究明确否定了稳态下角质形成细胞的核心作用，转而确立了真皮成纤维细胞和血管周围细胞作为关键“滋养细胞”的地位。这一发现强调了基质细胞微环境与免疫细胞之间的紧密空间偶联——肥大细胞必须紧邻KITLG的生产者才能存活，这与膜结合型KITLG的功能特性相符。该研究不仅为理解皮肤免疫稳态的组织学基础提供了确凿证据，也为未来干预肥大细胞相关的过敏性疾病、慢性炎症以及纤维化疾病提供了新的潜在靶点：即调控特定基质细胞亚群的KITLG表达，而非笼统地阻断整个KIT信号通路。