活性氧（ROS）能够提高小分子代谢物CEST体系中的质子交换速率（kex）

《Journal of Magnetic Resonance》：Reactive oxygen species (ROS) enhance proton exchange rate (kex) in a small-metabolite CEST system

　　梅兰·沙加吉 | 凯佳·蔡
伊利诺伊大学芝加哥分校放射科，美国伊利诺伊州芝加哥

**摘要**
活性氧（ROS）是氧化应激的关键生物标志物，与多种疾病有关，包括神经退行性和癌症。由于ROS浓度低且性质短暂，对其进行无创成像仍是一项技术挑战。在先前的研究中，我们证明了ROS（特别是羟基自由基）在使用蛋清组织的化学交换饱和转移（CEST）MRI实验中能够增强质子交换率（kex），蛋清是一种含有多种蛋白质和其他代谢物的复杂系统。本研究旨在使用一个简单的小分子代谢物系统——含有产生ROS的芬顿反应的肌酸溶液——进一步验证和确认这一现象。通过结合9.4 T CEST Z谱MRI实验和Bloch–McConnell建模，我们发现ROS诱导的肌酸CEST线宽增加主要与质子交换率增加有关，而非松弛变化。这些发现进一步支持将内源性kex映射作为体内ROS检测的有前景的MRI生物标志物，有助于研究和临床管理氧化应激相关病理。

**1. 引言**
活性氧（ROS）在细胞生理和病理中起着关键作用，是氧化损伤的主要因素。ROS生成失调是许多疾病（包括炎症性疾病、神经退行性病变、糖尿病和癌症）的发病机制基础，然而体内ROS的定量无创方法仍然有限。电子顺磁共振成像依赖于外源性自旋捕获剂或自旋探针，但由于内源性自由基浓度低和寿命短，在探针递送和临床应用方面面临重大挑战。同样，基于荧光的ROS成像也依赖于合成荧光探针，这些探针存在递送、特异性和组织穿透性受限的问题，从而限制了其临床应用[1]、[2]、[3]、[4]。因此，迫切需要能够高特异性和高灵敏度检测和定量ROS的内源性成像方法。
化学交换饱和转移（CEST）MRI已成为内源性代谢物分子成像的多功能技术。在CEST中，频率选择性的射频饱和作用于目标分子中的可交换质子（例如酰胺、胺或羟基团）；随后质子与水的交换将这种饱和转移到水信号中，产生与质子MRI相关的可检测对比度，这与质子交换动力学和可交换质子的浓度直接相关。因此，CEST Z谱的幅度和线宽编码了关于交换率（k??）、代谢物浓度和局部松弛特性的信息。重要的是，CEST MRI可以在常规临床扫描仪上实现，无需使用外源性造影剂，使其成为内源性分子和代谢成像的有吸引力的平台。最近的体外和体内CEST研究逐步探索了内源性MRI通过测量ROS对松弛时间[5]以及k??[4]的影响来检测活性氧（ROS）的潜力。这种方法对于无创监测氧化应激具有重大意义，特别是在ROS过度产生的疾病中具有临床应用潜力。
这些最新研究表明，ROS可以通过氧化催化机制调节质子交换率，这种机制独立于碱催化的交换机制（图1）[5]、[6]、[7]、[8]。具体来说，通过芬顿化学（Fe2+ + H2O2 → Fe3+ + OH? + ·OH）生成的羟基自由基（·OH）促进了生物分子上不稳定位点的质子抽取，从而加速了与水质子的质子交换并增强了k??。使用蛋清模型进行的研究表明，H2O2诱导的ROS生成增加了CEST k??，并同时改变了松弛时间（显著降低了T1，对T2的影响较小）[4]。然而，这种介质中含有来自蛋白质、肽和氨基酸的不同分子量的可交换质子。这种复杂性可能会掩盖与松弛驱动效应相比的交换驱动的光谱变化的特异性。

**2. 材料与方法**
所有化学试剂均为分析级，并按接收状态使用。肌酸模型是通过将肌酸一水合物（Sigma-Aldrich）溶解在磷酸盐缓冲盐水（PBS，pH 7.4）中制备的，最终浓度为20 mM。将10.9 mL的肌酸-PBS转移到试管中，并加入0.1 mL的新鲜鸡蛋白，其中含有微摩尔级别的天然铁，作为芬顿反应的催化剂。然后向每个试管中加入1 mL不同浓度的稀释过氧化氢（H2O2）溶液，最终H2O2浓度分别为0、8.1、32.4和80.9 mM，相当于0、0.025、0.1和0.25% v/v。这会在H2O2加入后一小时内生成芬顿反应中的羟基自由基（研究的ROS物种），浓度范围为0–～12 pM。估计的羟基自由基浓度是根据使用类似H2O2浓度和反应条件的先前研究[5]、[8]推断的，应视为数量级估计而非精确的定量测量。选择这个H2O2浓度范围是为了在生理水平的ROS生成下提供系统的剂量-反应评估[8]。

**2.1. MRI采集协议**
样品被转移到四个NMR试管中，并在室温下使用9.4特斯拉的小动物MRI扫描仪（Bruker）进行扫描，所有采集过程中的温度保持在20°C。
MR协议包括常规解剖成像、T1和T2映射以及CEST Z谱成像。对于T1映射，使用了具有可变反转时间（TI = 0.6、0.75、0.9、1.1、1.25、1.5、1.75、2和4 s）的快速自旋回波反转恢复序列，TE/TR = 5 ms/10 s，回波序列长度 = 8，矩阵大小 = 128 × 64。对于T2映射，使用了具有可变回波时间（TE = 12、25、50、75、100、200和500 ms）的快速自旋回波序列，TR = 6 s，回波序列长度 = 8，矩阵大小 = 128 × 128。
Z谱是使用基于FLASH的CEST脉冲序列获得的，该序列包含一个4秒的预饱和脉冲，饱和度为两个不同的功率（B1 = 1和2 μT），随后是一个4秒的T1延迟，以近似稳态饱和条件。Z谱在?5到+5 ppm的范围内以0.2 ppm的间隔采样，相对于水质子共振（设定为0 ppm），该范围旨在涵盖本研究中关注的肌酸共振（约1.9 ppm）。值得注意的是，在水溶液中报告了一个与H2O2相关的CEST特征，其可检测性强烈依赖于pH、温度和交换动力学，在较高pH下会降低，因为交换速度加快[9]、[10]。由于H2O2的质子交换也受到磷酸盐的催化，在我们的PBS条件下（pH ～7.4，20°C），分辨率良好的H2O2峰将不太明显，因为任何接近此偏移的贡献预计会与直接的水饱和/溢出重叠。由于我们的采集窗口仅扩展到±5 ppm，因此当前数据并未直接测试6.2 ppm的特征。所有谱都是在向肌酸-PBS样品中加入H2O2开始产生ROS后1小时获得的，以最小化时间依赖性效应。

**2.2. 数据分析**
所有数据处理都是使用在MATLAB（R2016a，MathWorks）中开发的自定义脚本进行的。T1和T2图是通过将信号拟合到标准的反转恢复和T2衰减模型来生成的。Z谱信号被归一化到?100 ppm处的非共振饱和信号，并以1?Mz/M0的形式绘制。然后Z谱被建模并拟合为两个洛伦兹函数的总和[11]：以0 ppm为中心的水直接饱和和以约2 ppm为中心的肌酸CEST峰。肌酸CEST峰的半高宽（FWHM，单位为Hz），此后称为Cr线宽（Cr LW），以及水直接饱和线宽（DS LW）作为主要读数。

**2.2.1. 数值模拟**
CEST峰线宽可能反映了质子交换率（k??）、松弛时间（T1和T2）和RF饱和参数[11]、[12]的综合影响。为了分离观察到的肌酸CEST线宽变化中的交换贡献和松弛效应，我们使用了基于实验条件的物理参数（RF幅度、浓度、松弛率）进行了双池Bloch–McConnell数值模拟，并独立变化了T1、T2和k??，同时保持其他参数不变。
双池Bloch–McConnell框架的模拟参数为：RF幅度（ω1 = 42.6 Hz或1 μT），饱和持续时间（4 s），肌酸质子池比例（fb = 0.03/110，大约相当于每个肌酸胍基团含有三个可交换质子），初始T1a = 2 s，T2a = 0.2 s，T1b = 1 s，T2b = 0.1 s，k?? = 600 s?1，以及化学偏移ωb = 1.9 ppm在9.4 T下。在双池Bloch–McConnell框架中，下标“a”表示 bulk water 质子池，而下标“b”表示肌酸可交换质子池。因此，T1a和T2a代表水质子的固有纵向和横向松弛时间，而T1b和T2b代表肌酸质子池的固有松弛时间。
为了系统地检查松弛时间（T1a和T2a）与k??对观察到的肌酸线宽变化的单独贡献，分别进行了三个不同的模拟系列，T1a（0.2到3.5 s）、T2a（0.05到0.5 s）和k??（50到1000 s?1）变化。每个模拟的Z谱都使用与实验数据相同的洛伦兹拟合方法进行分析。
通过将结果信号值拟合到标准的T1反转恢复和T2衰减模型，还确定了这些参数变化对观察到的松弛时间的影响。请注意，观察到的松弛时间（T1obs和T2obs）与质子交换系统中的固有松弛时间（T1a和T2a）不同。实验测量的松弛时间（T1和T2）对应于水信号的观察到的松弛时间（T1obs和T2obs），这些时间是由两个池之间的固有松弛和化学交换的耦合效应引起的。

**3. 结果**
肌酸-PBS模型的Z谱显示出一个明显的、定义明确的肌酸CEST峰，位于1.9 ppm，没有来自添加的少量蛋清的额外CEST信号（通常在约2.7 ppm）。这证实了所呈现的模型能够正确模拟用于研究ROS对小分子代谢物CEST系统影响的双池小分子交换系统。
向肌酸模型中逐步添加H2O2导致MRI可观测值的变化（图2）。具体来说，随着H2O2浓度从0增加到80.9 mM（大约相当于0–～12 pM范围内的羟基自由基浓度[5]），测量到的水质子T1从3.00 s减少到2.60 s，而T2从0.25 s减少到0.11 s。同时，肌酸和水的CEST线宽（Cr LW和DS LW）显著增加：肌酸从310 Hz（无ROS）增加到最大H2O2时的440 Hz，水从160 Hz（无ROS）增加到最大H2O2时的480 Hz。图2B–F展示了T1和T2图以及Cr LW和DS LW，表明线宽增加与松弛变化同时发生。图2D显示了在两种ROS水平（约1和约12 pM）下的代表性反转Z谱，显示了随着ROS增加峰线宽的扩大。

**下载：下载高分辨率图像（525KB）**
**下载：下载全尺寸图像**在PBS（20 mM）样品中，每个样品含有0.1 mL的蛋清作为Fenton反应的催化剂（总体积为11 mL），然后用1 mL的H2O2处理，以达到最终浓度分别为0%、0.025%、0.1%和0.25% v/v，这对应于在加入H2O2后1小时时羟基自由基的浓度大约为0、约1、约5和约12 pM，这些浓度是根据先前在类似反应条件下的文献推算得出的。(A) 样品位置排列。(B) 观察到的T1图谱。(C) 观察到的T2图谱。(D) 在两种ROS水平（1和12 pM）下的代表性倒Z谱，显示随着ROS的增加，CEST峰线宽明显变宽。(E–F) Z谱中肌酸峰（E）和水峰（F）的线宽，通过Lorentzian拟合计算得出。补充的Bloch–McConnell模拟提供了关于T1、T2和k??变化对肌酸CEST和水DS线宽影响的机制洞察，以及模拟的观察到的T1和T2值。仅增加T1会导致肌酸CEST峰逐渐变窄而水峰变宽，而增加模拟观察到的T1对模拟观察到的T2没有影响。相反，增加T2倾向于使水峰变窄同时增加Cr线宽（而不是变窄）；这也增加了模拟观察到的T2，并且对模拟观察到的T1没有影响（见图3和图4）。这些模式都没有一致地再现实验结果，因为在实验中线宽和松弛时间的变化方向是相反的。关键的是，只有模拟中k??的增加产生了实验观察到的松弛时间缩短和线宽变宽（见图5）。实验结果——即观察到的T1和T2都随着ROS水平的增加而减少，而Cr线宽和水线宽都增加了——因此支持ROS诱导的线宽扩展主要源于加速的质子交换，而不是松弛时间的变化。

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图3. 随着T1（左）或T2（右）的变化，肌酸（上）和水（下）CEST峰线宽的变化，通过数值模拟计算得出。数值模拟是通过使用以下初始参数解两个池的Bloch-McConnell方程来进行的：k?? = 600 s?1, fb = 0.03/110, T1? = 2 s, T2? = 0.2 s, T1b = 1 s, T2b = 0.1 s, ST = 4 s, ωb = 2π × 9.4 × 42.6 × 1.9 s?1, 和 ω1 = 2π × 42.6 s?1。下标“a”和“b”分别表示水池和肌酸质子池；实验报告的T1和T2对应于水信号的观察到的松弛时间。对于每个生成的Z谱，通过拟合两个Lorentzian函数来确定CEST峰的宽度。为了研究不同的松弛或交换率对CEST峰线宽的影响，每个参数（T1、T2或k??）在一系列模拟中独立变化，同时保持所有其他参数不变。T1或T2的变化导致线宽变化的方向相反，与观察到的数据不同，观察到的数据中两者都变宽。

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图4. 数值模拟中的代表性案例，显示随着T1（左）或T2（右）的变化，CEST峰线宽的变化方向相反。数值模拟是通过使用上述初始参数解两个池的Bloch–McConnell方程来进行的。T1或T2的变化导致线宽变化的方向相反。左图：T1从0.5秒增加到3.5秒导致水线宽增加，同时肌酸峰线宽变窄。右图：T2从0.1秒增加到0.4秒导致水线宽减少，同时肌酸峰线宽变宽。对于每个生成的Z谱，通过两个Lorentzian函数拟合来确定线宽（底部行）。

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图5. 实际观察到的松弛时间和CEST峰线宽（上）与Bloch–McConnell模拟（下）的比较，显示了实验结果与模拟的k??变化效应之间的一致性。随着k??的变化，观察到的松弛时间和CEST峰线宽的变化是通过数值模拟计算得出的。CEST峰线宽的增加伴随着观察到的松弛率的减少，这与k??值的增加是一致的。

4. 讨论
本研究旨在通过结合小分子质子交换系统的实验和模拟数据，验证ROS对质子交换率的具体影响，排除松弛时间作为混淆因素的可能性。我们的发现支持羟基自由基通过氧化催化机制加速质子交换。实验结果显示，在加入H2O2后松弛时间显著减少。对于小溶质分数和快速交换，松弛率大致呈线性组合。这意味着加入0.25%的H2O2对T1和T2的影响很小（< 2%的变化），考虑到水和H2O2的松弛率。要理解我们研究中观察到的松弛时间的显著变化，需要区分水池的固有松弛时间（T1,int和T2,int）和水观察到的松弛时间（T1,obs和T2,obs）。虽然后者与固有松弛值成线性比例，但观察到的松弛时间可能受到交换机制的显著影响，正如我们的模拟所示。我们结合实验和计算的结果提供了有力的证据，表明通过Fenton反应生成的羟基自由基加速了肌酸和水之间的质子交换，表现为CEST光谱峰的变宽。尽管松弛参数（T1和T2）也对ROS有响应而发生变化，但模拟显示它们对线宽的影响与观察到的结果不一致，因此排除了它们作为线宽变化的主要驱动因素。这种区分尤为重要，因为交换率和松弛率在塑造Z谱轮廓方面相互影响，正确分配因果关系对于定量使用CEST MRI作为氧化应激生物标志物至关重要。模拟方法——通过允许定量确定实验观察到的线宽增加是否主要归因于增强的交换率或改变的松弛性质——为ROS介导的k??增强提供了关键验证。已知质子交换率强烈依赖于pH值通过碱催化的机制。在本研究中，所有实验都在磷酸盐缓冲盐水（pH 7.4）中进行，最大H2O2浓度（0.25% v/v）相对于系统的缓冲能力来说是一个小的扰动[8]，因此不太可能发生显著的pH变化。我们的目标是设计一个小的分子双池交换系统，用于实验和理论比较ROS对CEST MRI的影响。为了触发肌酸溶液中的Fenton反应，我们最初评估了直接添加FeCl2，但由于在生理pH下Fe3+迅速沉淀而最终放弃了这一方法。相反，我们使用少量含有天然铁的蛋清作为Fenton反应的催化剂。尽管蛋清不代表一个化学定义的铁源，在生理pH下构建一个稳定的均匀Fe2+/H2O2 Fenton系统本质上具有挑战性，因为自由铁离子在中性缓冲液中会迅速氧化和/或沉淀[13]，[14]。在这种条件下，这种化学反应更适当地描述为类似Fenton的反应，由蛋白质结合或表面相关的铁介导，而不是经典均匀Fenton反应中的自由扩散Fe2+[13]。这些考虑解释了在缓冲MRI幻影中使用简单铁盐/过氧化物混合物的可行性有限，并激发了我们使用蛋清的原因。在蛋清中，铁主要与蛋白质结合（例如，与卵转铁蛋白结合），并且额外的酶途径可能有助于过氧化物的分解[8]。因此，蛋清/H2O2系统应被视为一个实用的、生物学相关的铁源，能够在生理pH条件下实现可重复的ROS生成，而不仅仅是一个化学定义的铁催化剂。正如我们的观察所证实的，我们幻影中的微量蛋清没有产生任何明显的CEST峰，其对双池小分子CEST系统的影响可以忽略不计。在这个框架内，缺乏蛋清衍生的CEST信号以及实验结果与交换驱动的Bloch–McConnell模拟的一致性支持了将线宽变宽归因于ROS介导的质子交换增强。肌酸CEST峰线宽对ROS的特定增强与松弛驱动的效果不同，验证了羟基自由基通过氧化催化机制增强小分子系统中质子交换率的假设。虽然之前的蛋清实验显示了类似的趋势[8]，但通过从异质幻影过渡到最小化的分子模型，我们消除了来自组成复杂性的混淆效应。经过验证的ROS增强的kex可以作为内源性ROS成像的定量替代指标，为高特异性和敏感性的非侵入性分子成像提供了途径，用于氧化应激的研究和临床管理。

5. 结论
本研究通过小分子CEST系统验证了ROS增强kex作为内源性ROS成像的定量替代指标，为高特异性和敏感性的非侵入性分子成像提供了途径，这对氧化应激相关疾病的研究和临床管理具有广泛的意义。

作者贡献声明
Mehran Shaghaghi：写作 – 审稿与编辑，写作 – 原始草稿，可视化，验证，方法学，调查，形式分析，数据管理，概念化。
Kejia Cai：资源，项目管理，资金获取，概念化。