多酚作为新型NPC1L1抑制剂：天然胆固醇吸收阻断剂的计算研究

《Journal of Molecular Graphics and Modelling》：Polyphenols as novel NPC1L1 inhibitors: A computational study of natural cholesterol uptake blockers

　　沙尚克·拉奥·帕杜比德里（Shashank Rao Padubidri）| 萨基巴·沙（Shakiba Shah）| 纳斯里·塔哈（Nasri Thaha）| K.V. 斯里拉克希米（K.V. Sreelakshmi）| 阿伦·普拉萨德·潘杜兰甘（Arun Prasad Pandurangan）| 布德赫斯瓦尔·德胡里（Budheswar Dehury）
生物信息学系，马尼帕尔生命科学学院，马尼帕尔高等教育学院，印度马尼帕尔-576104

**摘要**
Niemann–Pick C1-Like 1（NPC1L1）是主要的肠道转运蛋白，负责膳食胆固醇的吸收，同时也是治疗高胆固醇血症的有效靶点；然而，FDA批准的药物依折麦布（ezetimibe）的长期使用受到副作用的限制，这促使人们寻找更安全的替代品。在这项研究中，采用了一种综合的计算机模拟策略，结合了分子对接、嵌入脂质的全原子分子动力学模拟、主成分分析以及MM/PBSA结合自由能计算，来评估植物来源的多酚在生理相关条件下的NPC1L1抑制作用。四种化合物——cis-白藜芦醇苷（cis-resveratroloside）、eriocryptol-7-O-葡萄糖苷（erioidictyol-7-O-glucoside）、木犀草素-7-O-葡萄糖苷（luteolin-7-O-glucoside）和3,4-二咖啡酰奎宁酸（3,4-dicaffeoylquinic acid）——显示出生比依折麦布更强的结合亲和力，尤其是针对NPC1L1的颈部区域。与依折麦布不同，这些多酚主要定位在通道的中上部，并与Phe1101/Tyr1102形成π–π相互作用，并与Gln873/Leu877形成氢键。分子动力学分析表明，这些化合物能够增强复合物稳定性，具有有利的结合能量，并显著调节TM7–TM8环附近的脂质-蛋白质相互作用，而TM7–TM8环是胆固醇转运的关键区域。值得注意的是，木犀草素-7-O-葡萄糖苷和3,4-二咖啡酰奎宁酸在该区域显示出较高的脂质占据率，这提示它们可能通过空间阻断机制阻碍胆固醇的内化。总体而言，这些发现提供了分子层面的证据，表明选定的植物来源多酚通过不同于依折麦布的机制抑制NPC1L1，从而表明它们作为更安全的下一代胆固醇吸收抑制剂的潜力。

**引言**
胆固醇是细胞膜的基本组成部分，在维持膜流动性和调节其通透性方面起着关键作用。它还是许多生物活性甾体分子（如维生素D、性激素、胆汁酸及其衍生物）的构建块。胆固醇积累会导致多种疾病，包括脂质代谢紊乱、神经退行性疾病、心血管疾病和高胆固醇血症。这些状况可能导致动脉粥样硬化、肥胖、糖尿病和骨质疏松症。
胆固醇通过从头合成途径生成，这是一个涉及30个步骤的多酶过程，其中乙酰辅酶A（acetyl-CoA）作为初始底物。此外，胆固醇通过低密度脂蛋白（LDL）被吸收进入细胞，LDL通过细胞表面的低密度脂蛋白受体（LDLR）发挥作用。胆固醇的摄取还通过Neimann Pick C1 Like-1（NPC1L1）蛋白实现，而多余的胆固醇则通过ATP结合盒子亚家族A成员1（ABCA1）输出到血液中，或被酯化形成胆甾醇酯。
NPC1L1是一种具有13个跨膜结构域（TM）的高度糖基化蛋白，存在于肠上皮细胞的顶端表面以及肝细胞的典型膜中。它在胆固醇转运途径中的关键作用已得到充分证实。NPC1L1促进胆固醇从胆汁盐中的吸收，随后胆固醇被酯化形成乳糜微粒，并从细胞运输到肠道进行进一步处理。
NPC1L1由四个结构域组成：N端结构域（NTD）、跨膜结构域（TMD）、固醇感应结构域（SSD）和C端腔内结构域（CTD）。N端结构域负责识别血液中的胆固醇；当胆固醇与NTD结合时，会诱导其构象变化，然后穿过NTD传递到SSD并进入细胞。依折麦布是一种FDA批准的药物，它结合在连接NTD和SSD的隧道中。研究表明，依折麦布的结合会触发转录因子SREBP-2的激活，进而促进编码LDL受体和胆固醇合成酶的基因表达。
多酚是一类含有一个或多个芳香环的化合物，主要来源于植物。这些酚类化合物常被用作收敛剂、抗氧化剂、抗炎药、降压药和降脂药。多项研究表明，多酚具有抑制高胆固醇血症的作用。
在过去二十年里，许多研究小组和制药公司致力于寻找和治疗高胆固醇血症的药物分子。已确定的靶点包括抑制体内脂质吸收、脂质合成、胆固醇合成和脂质氧化等途径。目前最广泛接受的高胆固醇血症治疗药物是他汀类药物，它们专门针对参与胆固醇吸收和合成的蛋白质。例如依折麦布就靶向NPC1L1蛋白，参与胆固醇进入肠上皮细胞和肝细胞的过程。此外，蛋白酶转化酶亚家族9（PCSK9）也是高胆固醇血症的治疗靶点，已有几种抑制剂（如Alirocumab和Evolocumab）获得FDA批准。多项研究还表明，高胆固醇血症与其他代谢性疾病（如糖尿病、非酒精性脂肪肝病、高血压和动脉粥样硬化）之间存在关联。
尽管在降低或缓解高胆固醇血症方面取得了进展，但FDA批准的药物仍存在一定的长期副作用。例如，依折麦布作为NPC1L1抑制剂不能长期使用，因为它会减少体内的脂溶性维生素；如果长期使用，还需要补充口服脂溶性维生素。因此，寻找具有最小副作用的新NPC1L1抑制剂对于全面理解脂质代谢和开发创新的降胆固醇疗法至关重要。为了加速基于天然产物的药物发现过程，我们采用了一种综合的计算结构驱动的药物设计方法，从文献和公共数据库中筛选出具有强抑制作用的潜在多酚。Sirvent等人的研究表明，某些多酚提取物（如TOTUM-070）在降低低密度胆固醇水平和其他致动脉粥样硬化脂质参数方面显示出良好效果，但仅适用于预防高胆固醇血症，并非作为疾病的治疗药物。Liu等人的研究也显示，某种多酚（parthenolide）能够降低细胞系中NPC1L1的表达。虽然这些研究表明多酚是有效的NPC1L1抑制剂，但尚无证据说明它们在POPc（脂质）、胆固醇和水环境中的相互作用机制。最新研究显示，像木犀草素和槲皮素这样的多酚通过与其细胞外结构域结合，直接抑制NPC11介导的胆固醇吸收，类似于依折麦布的作用机制——通过诱导构象变化来阻止胆固醇的内吞作用。这些化合物的芳香环上含有多个羟基，能够与NPC11的MLD关键残基形成氢键和疏水相互作用，这一点通过冷冻电镜结构与分子对接模拟得到了证实。因此，我们进一步研究了具有较高NPC11结合亲和力的多酚，在类似生理条件的脂质模拟双层中利用先进的分子动力学（MD）模拟来阐明其结构动态。我们还分析了结合NPC11的抑制剂的三维灵活性和整体运动，并将其与依折麦布（实验系统）进行比较，以了解这些复合物在POPc和胆固醇环境中的差异动态。最后，我们进行了终点自由能计算和自由能分解分析，以确定影响多酚与NPC1L1受体结合自由能的各种因素。这将有助于开发天然来源的NPC1L1抑制剂，有效治疗高胆固醇血症。

**材料与方法**
**蛋白质制备**
从蛋白质数据库（PDB ID: 7DFZ）下载了与依折麦布结合的NPC1L1蛋白。使用PyMOL（PyMOL Molecular Graphics System，版本3.0，Schr?dinger, LLC）去除了NPC1L1-依折麦布复合物上的7个糖分子。使用Schr?dinger套件的蛋白质制备向导，在pH 7.0的默认质子化状态下准备了NPC1L1的全蛋白结构。使用Receptor Grid Generation Wizard在依折麦布结合位点生成活性位点以用于对接。

**多酚的收集与筛选**
我们从多个数据库和研究论文中收集了191种多酚，并从PubChem数据库中获取了它们的三维（3D）结构（格式为“.sdf”）。对于没有3D结构的小分子，使用ChemDraw工具绘制后转换为3D坐标。使用Maestro 12.8（Schr?dinger Release 2024-1: LigPrep，Schr?dinger, LLC，纽约，2024）的LigPrep工具处理这些小分子，以观察其与NPC1L1的相互作用。配置算法为pH 7（±2），通过Epik模块估算它们的pKa值。每种多酚最多保留32个立体异构体，并使用OPLS4力场优化其低能量3D构象。收集的多酚及其二维结构列于表S1中。

**分子对接**
使用Schr?dinger的Maestro Interface（Schr?dinger Release 2024-1: Maestro，Schr?dinger, LLC，纽约，2024）基于Glide模块的标准精度（SP）和额外精度（XP）进行分子对接。具有小于-7分（SP方法）和小于-12分（XP方法）的配体被认为是良好的结合候选者。进一步使用Schr?dinger套件的Prime分子力学-广义Born表面面积（MM-GBSA）方法计算结合亲和力。具有高SP、XP和MM-GBSA得分的多酚被筛选出来进行进一步分析。使用Schr?dinger的QikProp模块评估这些最佳候选多酚的药剂学相关性质。

**MD模拟系统的准备**
根据上述对接结果，将结合亲和力最高的四种化合物提交给CHARMM-GUI，用于构建蛋白质-配体-脂质-水系统。跨膜蛋白-配体体系使用1-棕榈酰-2-油酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺（POPE）和胆固醇以3:1的比例配制，上下叶片和TIP3P水分子也采用相同比例。采用蒙特卡洛方法放置离子，盐（NaCl）浓度为0.15M以中和系统。这一设置过程适用于所有选定的四种蛋白质-配体复合物以及对照NPC1L1（PDB ID: 7DFZ）复合物。使用CHARMM36m生成的设置文件作为GROMACS v2021.4的输入进行模拟。
四种选定配体的力场参数来自CHARMM36力场，通过CHARMM-GUI Ligand Reader & Modeler模块实现。初始的配体结构以Mol2格式上传到服务器，系统自动分配原子类型、键长、角度和二面角参数，以及基于CGenFF类比的偏电荷。使用标准的CGenFF电荷推导协议进行偏电荷分配，该协议涉及半经验计算和与力场中现有化学基团的类比。为了确保这些参数在膜蛋白模拟中的可靠性，我们仔细审查了CGenFF服务器为每种配体生成的惩罚分数。因此，配体拓扑结构直接与CHARMM36m蛋白质和脂质参数集成，确保整个蛋白质-配体-脂质系统的一致性。

**全原子MD模拟**
使用GROMACS v2021.4包进行全原子MD模拟，输入文件来自CHARMM-GUI。使用CHARMM36m力场生成蛋白质和配体的拓扑结构，并将系统溶解在八边形盒子中。离子和脂质使用标准的CHARMM36参数表征，TIP3P模型用于水分子，这是一种成熟的膜蛋白模拟力场。通过0.15 M Na+和Cl-反驳离子电中性化每个系统后，使用最陡下降算法进行能量最小化，迭代次数为5000步，以准备后续平衡过程。每个系统均采用CHARMM-GUI的默认六步平衡协议。模拟过程中所有共价键合的氢原子受到LINCS算法的限制。非键合的范德华相互作用使用Lennard-Jones势计算，截止半径为1.2 nm。电静力相互作用使用平滑粒子网格Ewald方法评估，实空间截止半径也为1.2 nm。鼻子吸盘法被用来将温度维持在303.15 K，而Parrinello-Rahman算法则帮助压力在1巴时达到平衡。随后，使用Leap-Frog积分器执行了300纳秒的分子动力学（MD）模拟。每个复合物内的非键合相互作用通过Verlet截止方案进行管理，长程静电力相互作用则采用粒子网格Ewald（PME）方法处理。每个系统的固有动力学通过MD轨迹计算得出，如构象稳定性、灵活性、紧凑性以及所占的溶剂可及表面积，这些通过GROMACS的各种内置模块进行分析。此外，2D图谱使用了XmGrace、VMD和PyMOL 36, 37生成。

通过计算与用于生产MD的起始结构相比的骨架根均方根偏差（RMSD）、Cα根均方根波动（RMSF）、回转半径（Rg）和溶剂可及表面积（SASA）来推断NPC1L1复合物的结构动态。使用gmx hbond实用工具包并在0.35纳米的距离截止下，绘制了NPC1L1与配体在300纳秒时间尺度上的分子间氢键。

主成分分析和动态互相关分析采用了主成分分析（PCA）这一综合性统计方法，利用最后200纳秒的MD轨迹来探索配体结合时NPC1L1的构象变化。GROMACS提供了两个分析主成分的内置工具：gmx covar和gmx anaeig。gmx covar工具用于使用系统的主要原子构建协方差矩阵，以生成表示MD复合物相关运动的对角特征向量（EVs）。GMX anaeig工具用于计算EVs及其在相空间中的相关投影。使用GROMACS的gmx sham模块进行了自由能景观（FEL）分析，以检查每个复合物的主要蛋白质构象状态。使用Bio3D中的MD轨迹生成了动态互相关图（DCCMs），以评估原子运动之间的相关性及其随时间的变化。

为了研究NPC1L1-多酚复合物的构象异质性，我们采用了基于GROMOS算法的聚类方法，并设置了0.2纳米的截止半径。随后对每个复合物中的主要簇进行了分子间接触分析以进行视觉检查。使用gmx hbond实用工具和0.35纳米的截止值，测量了NPC1L1残基与多酚系统之间的分子间氢键。

MM-PBSA自由能计算和二级结构评估使用了gmx_mmpbsa包进行了MM-PBSA计算，并结合了残基分解分析。自由能估计是在保持在298 K的MD轨迹的最后100纳秒内提取的200个等距帧上计算的。对于分解分析，选择了位于配体质心8 ?半径范围内的残基。使用DSSP检查了模拟轨迹上二级结构元素的演变，并使用CONAN生成接触图，以识别每个系统中持续的残基级相互作用。

为了阐明脂质（POPE）和胆固醇在NPC1L1-多酚复合物结合过程中的调控和结构作用，我们专注于识别和表征特定的NPC1L1-脂质相互作用，并确定配体结合位点附近的脂质。使用了PyLipID这个Python包来检测结合位点、脂质结合的占有率及停留时间。定义了一个双截止值范围（0.35至0.55纳米），以确定脂质与蛋白质表面的接触。

高胆固醇血症是一种由体内低密度脂蛋白和血浆胆固醇水平过高引起的代谢性疾病。有许多治疗高胆固醇血症的方法可供选择，例如他汀类药物和依折麦布。尽管依折麦布是获得FDA批准的治疗高胆固醇血症的药物，但它具有多种副作用。NPC1L1（如图1所示）仍然是对抗高胆固醇血症的重要药物靶点之一。由于可用的药物有限，迫切需要开发针对这一重要跨膜受体的新型抑制剂。大量研究表明，天然多酚由于具有高生物利用率、经济合成性和良好的安全性，能够有效缓解糖尿病和高胆固醇血症等代谢性疾病。本研究利用最先进的计算工具证明了植物源多酚作为NPC1L1强效抑制剂的潜力，为植物药理学作为胆固醇吸收抑制剂的发展开辟了新的途径。

结果与讨论：高胆固醇血症是由于体内低密度脂蛋白和血浆胆固醇水平过高引起的代谢紊乱。有许多治疗高胆固醇血症的方法，例如他汀类药物和依折麦布。虽然依折麦布是一种被FDA批准用于治疗高胆固醇血症的药物，但它存在多种副作用。如图1所示，NPC1L1仍然是研究中的重要药物靶点之一。由于可用药物有限，开发针对这一重要跨膜受体的新型抑制剂十分必要。许多研究记录了天然多酚在缓解糖尿病和高胆固醇血症等代谢性疾病方面的有效性，因为它们具有高生物利用率、经济可行的合成方法和良好的安全性。本研究使用最先进的计算工具证明了植物源多酚作为NPC1L1强效抑制剂的潜力，为植物药理学的发展提供了新的方向。

图1：在没有（PDB:7DF8）和有依折麦布（7DFZ）的情况下孵育的富胆固醇状态下NTD截短的人类NPC1L1结构。左图：含有依折麦布的NPC11的重要结构特征，胆固醇分子和结合的依折麦布分子以球体形式显示。中图：NTD截短的人类NPC11结合和未结合状态的結構重叠图。右图：浸没在脂质双层中的依折麦布-NPC1L1结构（以球体形式显示）。

NP1CL1对多酚的分子识别：分子对接是一种计算方法，用于确定和筛选与受体具有高结合亲和力的小分子，从而识别有前景的先导化合物。在本研究中，我们使用了GLIDE的SP和XP评分系统以及195种多酚的MM-GBSA评分（表S1）来识别潜在的NPC1L1蛋白抑制剂。我们识别出10种在所有评分指标（SP、XP、MM-GBSA）中一致性结合亲和力较高的化合物（表1）。其中，Luteolin-7-O-glucoside、cis-Resveratroloside、3,4-Dicaffeoylquinic acid和Eriodictyol-7-O-glucoside的评分分别为-13.41、-13.11、-13.05和-13.06 kcal/mol，这些评分明显高于依折麦布，表明它们可能对NPC1L1具有更强的亲和力，因此被进一步评估。

表1：通过Glide对接获得的NPC1L1与选定顶级多酚之间的结合亲和力、对接评分以及各种残基建立的相互作用。一致参与形成氢键接触的残基用粗体标出。

超胆固醇血症是一种由体内低密度脂蛋白和血浆胆固醇水平过高引起的代谢紊乱。目前有许多治疗高胆固醇血症的方法，例如他汀类药物和依折麦布。尽管依折麦布是FDA批准的治疗高胆固醇血症的药物，但它具有多种副作用。如图1所示，NPC1L1仍然是研究中的重要药物靶点之一。鉴于可用药物有限，迫切需要开发针对这一重要跨膜受体的新型抑制剂。许多研究表明，天然多酚由于其高生物利用率、经济可行的合成方法和良好的安全性，在缓解糖尿病和高胆固醇血症等代谢性疾病方面有效。本研究使用最先进的计算工具证明了植物源多酚作为NPC1L1强效抑制剂的潜力，为开发植物药理学作为胆固醇吸收抑制剂提供了新的方向。

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图1：在没有（PDB:7DF8）和有依折麦布（7DFZ）的情况下孵育的富含胆固醇状态下NTD截短的人类NPC1L1结构。左图：含有依折麦布的NPC11的重要结构特征，胆固醇分子和结合的依折麦布分子以球体形式显示。中图：结合和未结合状态的NTD截短的人类NPC11的结构重叠图。右图：浸没在脂质双层中的依折麦布-NPC1L1结构（以球体形式显示）。

NP1CL1对多酚的分子识别：分子对接是一种计算方法，用于确定和筛选与受体具有高结合亲和力的小分子，从而识别有前景的先导化合物。在本研究中，我们使用了GLIDE的SP和XP评分系统以及195种多酚的MM-GBSA评分（表S1）来识别潜在的NPC1L1蛋白抑制剂。我们识别出10种在所有评分指标（SP、XP、MM-GBSA）中结合亲和力始终较高的化合物（表1）。其中，Luteolin-7-O-glucoside、cis-Resveratroloside、3,4-Dicaffeoylquinic acid和Eriodictyol-7-O-glucoside的表现最为突出，其XP对接评分分别为-13.41、-13.11、-13.05和-13.06 kcal/mol。这些评分明显高于依折麦布，表明它们可能对NPC1L1具有更强的亲和力，因此被进一步评估。

表1：NPC1L1与选定的顶级多酚通过Glide对接建立的结合亲和力、对接评分以及各种残基之间的相互作用。一致参与形成氢键接触的残基用粗体标出。

PubChem CID：
化合物 | SP评分（kcal/mol）| XP评分（kcal/mol）| MM-GBSA评分 | 形成氢键、静电和疏水接触的残基（氢键用粗体标出）
--- | --- | --- | --- | ---
Luteolin-7-O-glucoside | 9.29 | -13.41 | -33.92 | Trp38, Val69, Leu123, Ile69, Ala76, Val116
Cis-resveratroloside | 9.03 | -13.11 | -46.54 | Trp38, Gln87, Tyr110, Ile62, Ala87, Val697, Ala76, Leu123
Eriodictyol-7-O-glucoside | 9.22 | -13.06 | -29.15 | Trp38, Leu123, Ala876, Tyr1102, Ala768, Val1166, Ile625, Val697, Ala876, Ala123
3,4-dicaffeoylquinic acid | 9.24 | -13.05 | -40.05 | Trp38, Gln87, Val697, Ile698, Ala768, Val116
Apigenin -7-O-glucoside | 9.06 | -13.02 | -43.35 | Trp38, Gln873, Tyr1102, Val697, Ala876, Val116
Naringenin-7-O-glucoside | 9.47 | -12.33 | -52.77 | Trp383, Gln873, Trp383, Ile698, Ala768
Trans-resveratroloside | 9.25 | -12.74 | -60.06 | Trp383, Gln873, Tyr1105, Leu871, Ile625, Ala876, Val697, Leu123

表1展示了前四种化合物的对接评分、XP评分、MM-GBSA能量计算结果以及NPC11与多酚形成不同非键合接触（包括氢键、疏水和静电接触）的残基。与依折麦布结合到NPC1L1的实验结构（7DFZ）类似，结合位点由颈部螺旋、连接子2、连接子8以及跨膜段TM5、TM7、TM11和TM13的疏水残基形成。仔细观察发现，所有分子都沿着从腔内结构域延伸到跨膜结构域（TMD）的中心通道排列，其中排名靠前的多酚占据由中间细胞质结构域界面和颈部区域形成的通道的上部和中部，而依折麦布位于颈部区域和通向TMD的通道下部。图1展示了参与胆固醇转运的TM螺旋和重要连接子及环的结构。与依折麦布类似，还发现了Phe1101和Tyr1102之间的π-π相互作用。此外，Hu等人还证明Gln873和Leu877可以在NPC11内与依折麦布形成潜在的氢键。我们的结果也与他们的研究一致，表明Gln873与cis-resveratroloside、Eriodictyol-7-O-glucoside、Apigenin-7-O-glucoside、Naringenin-7-O-glucoside和Trans-resveratroloside形成了关键的氢键。此外，我们还观察到Trp383也与排名靠前的多酚形成了潜在的氢键。

表1中的前四种化合物的对接评分高于依折麦布，当它们与NPC1L1结合时，其结构与实验结果正确吻合（图S3）。图2展示了前四种配体与NPC11膜蛋白的非键合相互作用，其中Gln873是一种对胆固醇识别和结合至关重要的氨基酸，它与Cis-resverato
roside和Eriodictyol-7-O-glucoside形成了强氢键。这些多酚的鉴定为开发新型NPC1L1抑制剂提供了有希望的起点。它们能够在NPC11的胆固醇感应区域参与关键的氢键和疏水相互作用，表明它们可能具有竞争性地抑制胆固醇吸收的潜力，从而为现有治疗剂（如依折麦布）提供天然替代品或补充剂。现有文献也表明，上述每种多酚均表现出抑制活性。

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图2：NPC11颈部区域中多酚的潜在结合位点，以及四种有前景的化合物（Luteolin-7-O-glucoside、Cis-resverato
roside、Eriodictyol-7-O-glucide和3,4-dicaffeoylquinic acid）与受体的高结合亲和力。与这四种化合物形成氢键的残基以球棍形式显示，疏水接触以半圆圈形式显示。交互图使用LigPlot+生成。

MDS为研究生物分子系统（包括蛋白质、酶和脂质-蛋白质复合物）在水或电解质环境中的动态行为和结构演化提供了巨大潜力。像NPC1L1这样的膜蛋白在缓解高胆固醇血症方面是重要的治疗靶点，药理学物质通过调节它们的活性来恢复或抑制其生物功能。阐明NPC11与其天然脂质环境（包括脂质和胆固醇）中小分子的结合方式和功能机制，不仅对基础和应用研究至关重要，还能提供关于NPC11介导的胆固醇内化和抑制的前所未有的机制洞察。此外，这些方法对于合理设计下一代胆固醇吸收抑制剂也有重要意义。

评估小分子的类药性质是筛选治疗代谢性疾病药物的关键步骤。ADMET研究表明，这四种多酚均能被中枢神经系统适度吸收，并且根据AMES分类属于低毒性，因此可以考虑进一步评估。为了评估NPC1L1-多酚和依折麦布结合复合物的动态稳定性和构象灵活性，我们分析了300纳秒MD模拟过程中骨架原子的RMSD、配体RMSD、Cα原子的RMSF以及通过Rg表示的紧凑性。所有复合物的骨架原子RMSD的分析结果表明它们在系统中的稳定性（图3A）。观察到所有NPC11-多酚复合物在初步平衡后都稳定了，其值在2-4 ?之间波动。四种NPC11-多酚复合物的平均RMSD低于对照组（3.28 ?），表明它们具有较高的稳定性。每个系统的结构动态统计总结在表S3中。

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图3：在300纳秒的时间内，NPC1L1与药物依折麦布和多酚在脂质双层中的动态稳定性和构象灵活性。（A）依折麦布和所有四种对接复合物的蛋白质骨架RMSD。当与依折麦布和其他配体结合时，蛋白质的总体稳定性没有显著变化。（B）配体与蛋白质结合时的RMSD。除Eriodictyol-7-O-glucide在100纳秒时不稳定外，所有配体都保持稳定。（C）显示蛋白质与配体结合后紧凑性的回转半径。所有配体与蛋白质结合后都显得相当紧凑，与对照组相比变化不大。（D）蛋白质与配体结合时所有残基的RMSF。与Eriodictyol-7-O-glucide结合的NPC11蛋白质的灵活性较低。

了解配体的稳定性与评估蛋白质的稳定性同样重要，因此对所有复合物的配体RMSD进行了评估（图3B）。观察到cis-resverato
roside和3,4-dicaffeoylquinic acid保持了稳定的结合，表现为一致的低调配体RMSD。然而，eriodicytol-7-O-葡萄糖苷和luteolin 7-O-葡萄糖苷在90到100 ns之间表现出显著的偏差，代表了暂时的不稳定性。除了RMSD之外，还通过绘制Rg曲线与用于生产MD的初始结构来计算每个系统的紧凑性。稳定的Rg值表示结构正确折叠，而不稳定的Rg值表示结构错误折叠。在我们的分析中，cis-resveratroloside的回转半径最低，平均值为35.4±0.13 ?，而eriodicytol-7-O-葡萄糖苷的Rg值最高（35.67±0.1 ?）。所有化合物都显示出稳定的Rg趋势，表明NPC1L1-多酚复合物的整体紧凑性得到保持，没有显著的解折叠事件（图3C）。测量了C原子的RMSF以了解NPC1L1-配体复合物系统中每个残基的波动程度或灵活性。如图3D所示，核心区域（残基约500-1000）的波动最小，而末端区域的波动最大，这是所有灵活蛋白质的共同特征。有趣的是，NPC1L1—Eriodicytol-7-O-葡萄糖苷的灵活性最低，表明配体结合后构象约束更紧。距离ezetimibe结合位点5 ?内的关键活性位点的最小和最大RMSF分别为0.72 ?和1.43 ?（图S4）。

为了深入了解每个蛋白质-抑制剂复合物的结构动力学和集体运动，我们基于原子波动的协方差矩阵得到的特征向量（EVs）和特征值进行了PCA分析。图S5A显示了前10个特征向量的特征值分布，揭示了ezetimibe和eriodicytol-7-O-葡萄糖苷结合的复合物占据了初始两个特征向量中最大的构象空间，并在后五个特征向量中稳定下来。相比之下，3,4-二咖啡酰奎宁酸和luteolin-7-O-葡萄糖苷复合物在前两个特征向量中占据的构象空间最小，表明它们的灵活性较低。图S5B表示前两个主成分（PCs）的散点图，其中ezetimibe和eriodicytol-7-O-葡萄糖苷结合的复合物显示出广泛的分布，表明其具有显著的动力学运动，而luteolin-7-O-葡萄糖苷和3,4-二咖啡酰奎宁酸复合物则聚集紧密，这与先前的研究结果一致。

图4中的刺猬图显示了抑制剂结合蛋白沿其第一个主成分（PC）的整体运动和方向。（A）NPC1L1—ezetimibe复合物中，在细胞外区域以及跨膜区域内的环3-4和7-8观察到适度的向外运动（如图4B所示），表明蛋白质结构没有显著的结构紊乱。（B）NPC1L1—luteolin-7-O-葡萄糖苷复合物中，在细胞质区域观察到向内的运动，而在TM1螺旋中观察到轻微的运动，表明跨膜区域的蛋白质结构变化有限。对于eriodicytol-7-O-葡萄糖苷（图4C），我们在细胞质区域观察到适度的向内和向外运动，而在跨膜区域的环3-4和7-8以及结合位点附近的环中观察到向外的运动，表明其在干扰胆固醇运输中的重要作用。我们注意到在cis-resveratroloside（图4D）的细胞质区域有明显的位移，而在3,4-二咖啡酰奎宁酸（图4E）中观察到轻微的运动，表明它们在减少胆固醇向细胞转运中的重要性。Saha等人和Hu等人的先前研究表明，环7-8和3-4对胆固醇摄取至关重要，这些环的构象变化会损害flotillin的结合和NPC1L1的功能，这支持了我们的发现。所有复合物的FEL计算结果如图S6所示。与对照NPC1L1—ezetimibe复合物相比，后者显示出两个明显的低能量状态，而配体结合的复合物表现出明显的配体特异性构象重塑。

对NPC1L1蛋白与ezetimibe及四种多酚复合物的C-α原子进行了动态互相关分析，以评估配体诱导的构象动力学。该分析基于300 ns的轨迹，将残基运动的相关性从-1（完全反相关，紫色）映射到+1（完全相关，蓝色）（图5）。所有系统中的一个共同发现是关键结合残基（500-700）之间存在强烈的负相关（反相关运动）。相比之下，两种复合物的整体相关性曲线有显著差异：3,4-二咖啡酰奎宁酸和cis-resveratroloside在整个蛋白质结构中显示出正负相关的混合，表明对蛋白质动态网络有明显的影响。

为了研究复合物之间的异质性，我们采用了聚类方法来比较对照复合物和蛋白质-多酚复合物。图6展示了蛋白质残基与不同多酚的相互作用，涉及相互作用的残基已在表S4中列出。我们能够识别出所有复合物中Trp383的关键疏水相互作用，该残基被黄等人认为是蛋白质上的主要胆固醇结合位点之一。此外，在luteolin-7-O-葡萄糖苷、eriodicytol-7-O-葡萄糖苷和cis-resveratroloside中还发现了与Gln873的配体相互作用，这些相互作用在MDS后仍然存在。这种特定的相互作用反映了NPC1L1—ezetimibe复合物中观察到的氢键，这是抑制NPC1L1活性的关键结合特征。我们还注意到，eriodicytol-7-O-葡萄糖苷和cis-resveratroloside与V697和A768的疏水相互作用密切，这导致了NPC1L1中的空间位阻，正如Hu等人所报道的。

测量氢键（HB）随时间的变化是理解配体与蛋白质之间分子间氢键动力学的关键步骤，以确定配体-受体的特异性以及它们整体结合亲和力的贡献。在这项研究中，我们监测了四种多酚与NPC1L1在整个模拟过程中形成的分子间氢键。如图7所示，所有多酚结合的复合物的氢键数量都较多，平均超过3个，而对照组（ezetimibe）复合物的平均氢键数量不到2.5个。这种模式表明多酚的结合亲和力比对照组系统更强。

为了更深入地了解每个复合物中相互作用的结合特性和强度，我们对五个系统进行了MM/PBSA自由能计算，使用了模拟最后100 ns内的200个快照。这些计算旨在确定每个复合物在气相、溶剂化相和组合条件下的能量状态，从而帮助我们解释个别残基对整体自由能变化的贡献。Valdivia等人之前的研究表明，胆固醇结合的NPC1L1在气相中的自由能变化为-16.0 kcal/mol，在溶剂化相中的自由能变化为20.8 kcal/mol。众所周知，蛋白质-抑制剂复合物的Gibbs自由能变化越低，其抑制潜力越强。在我们的研究中，我们重点关注了气相中的范德华力和静电力成分，以及溶剂化相中的极性和非极性成分对ΔG的贡献（图8A）。在五个复合物中，3,4-二咖啡酰奎宁酸表现出最有利的结合，其ΔG最低，为-28.16 kcal/mol。相比之下，resveratroloside的结合不太有利，其ΔG仅为-2.17 kcal/mol（图8B和表2）。

为了进一步理解这些变化，我们进行了残基级别的能量分解。记录了结合位点5 ?范围内的残基贡献，并以堆叠条形图的形式可视化（图9）。有趣的是，关键残基如Trp383在所有复合物中始终显示出低自由能。像Leu1234、Phe1101、Leu871、Ala876和Leu621这样的残基在含有eriodicytol-7-O-葡萄糖苷和luteolin-7-O-葡萄糖苷的复合物中对结合能量的贡献最小。总体而言，分解分析显示cis-resveratroloside和3,4-二咖啡酰奎宁酸的结合亲和力显著强于eriodicytol-7-O-葡萄糖苷和luteolin-7-O-葡萄糖苷，突显了它们作为更有效的抑制剂的潜力。DSSP分析证明了与四种多酚形成的NPC1L1复合物与实验确定的ezetimibe复合物之间的结构一致性，在核心二级结构元素中没有观察到重大扰动（图S7）。

最近的研究强调了蛋白质-脂质相互作用在药物发现中的关键作用，特别是对于膜蛋白而言，这些相互作用显著影响蛋白质的结构、动力学和功能，最终影响配体结合和药理反应。在这项研究中，我们探讨了NPC1L1-多酚复合物中脂质-蛋白质相互作用的变化，并计算了每个复合物的占据率和驻留时间。在这里，占据率通过测量脂质物种在特定蛋白质残基附近出现的频率来突出显示脂质结合热点。相比之下，驻留时间反映了结合脂质的动力学、稳定性和松弛情况，识别出参与长期脂质-蛋白质关联的残基。表S5总结了每个复合物中脂质占据率最高的前十个残基。在对照组系统中，这些残基主要位于TM9、TM7–TM8环和TM5中，表明这些区域在减少胆固醇跨膜运输中起关键作用。有趣的是，在NPC1L1—luteolin-7-O-葡萄糖苷复合物中，十个高占据率的残基中有七个位于TM7–TM8环内，每个TM6和TM9中各有一个。这表明TM7–TM8环在该复合物中的胆固醇运输中仍然是一个关键区域。同样，在3,4-二咖啡酰奎宁酸复合物中，十个高占据率的残基中有九个位于TM7–TM8环内，进一步强调了其在介导脂质相互作用中的重要性。

除了脂质结合位点外，我们还研究了有前景的胆固醇结合位点。我们观察到对照组包含两个胆固醇结合位点（图10A），而luteolin-7-O-葡萄糖苷和eriodictyol-7-O-葡萄糖苷复合物各有一个结合位点（图10B和C）。值得注意的是，对照组中观察到的两种胆固醇是Hu等人在实验结构中报告的五个胆固醇结合位点中的两个。ezetimibe复合物中的一个胆固醇分子与eriodicytol-7-O-葡萄糖苷共享一个结合位点，表明它们在Leu1158和Trp1159残基处的相互作用可能存在竞争或重叠。胆固醇与木犀草素-7-O-葡萄糖苷之间的相互作用残基包括Val1146、Leu1149和Val1150。下载：下载高分辨率图像（771KB）下载：下载全尺寸图像。图10. NPC1L1-配体复合物中脂质结合位点的可视化，突出显示了通过MD模拟获得的高脂质占据区域。胆固醇分子使用空间填充模型以青绿色表示。(A) NPC1L1-依折麦布复合物中的脂质结合口袋。(B) NPC1L1-芹菜素-7-O-葡萄糖苷复合物中的脂质结合区域。(C) NPC1L1-木犀草素-7-O-葡萄糖苷复合物中的脂质结合相互作用。研究更多基于植物的抑制剂有助于减少这些化合物的副作用并延长其使用时间，与依折麦布不同，后者在长期使用时会有副作用。这项研究深入探讨了蛋白质-配体和蛋白质-脂质相互作用，使我们能够了解蛋白质的主要区域如何调节体内的脂质 transport。还需要进一步研究这些多酚如何通过体外和体内验证改变体内的胆固醇 transport，并影响肠道微生物群，正如Langhi等人所解释的那样。75还应进行研究以了解它们抑制甾醇调节元件结合蛋白2（SREBP2）的能力，因为当NPC1L1和SREBP2都被抑制时，胆固醇水平会下降，正如Mardini-Nafchi等人在综述中所示。76结论Niemann–Pick C1样1（NPC1L1）蛋白在肠道胆固醇吸收中起核心作用，仍然是高胆固醇血症的有效治疗靶点。尽管依折麦布能有效抑制NPC1L1，但其长期使用会伴随不良副作用，因此需要探索更安全、更可持续的替代品。在这项研究中，我们采用了一种综合的计算机模拟框架，结合了分子对接、脂质双层嵌入的全原子分子动力学（MD）模拟、主成分分析（PCA）和MM/PBSA结合自由能计算，系统地评估了植物来源的多酚作为潜在的NPC1L1抑制剂。我们的计算筛选确定了四种多酚化合物——木犀草素-7-O-葡萄糖苷、芹菜素-7-O-葡萄糖苷、顺式白藜芦醇苷和3,4-二咖啡酰奎宁酸——作为高亲和力的NPC1L1结合剂，其对接分数（XP：?13.41至?13.05 kcal/mol）优于依折麦布。MD模拟表明，多酚结合复合物表现出更高的结构稳定性，这体现在较低的RMSD值、稳定的回转半径以及与参考药物相比增强的分子间氢键上。这些相互作用主要由保守的残基介导，例如Gln873和Trp383，这些残基对胆固醇的识别和运输至关重要。进一步的动态分析显示，多酚结合诱导了3-4环和7-8环的显著构象重排，这些区域对于flotillin依赖性的NPC1L1内化和胆固醇吸收至关重要。在筛选的化合物中，3,4-二咖啡酰奎宁酸表现出最强的抑制作用，结合自由能（ΔG=?28.16 kcal/mol），超过了依折麦布。此外，特别是在TM7–TM8胆固醇运输域附近的多酚-蛋白质相互作用调节表明，可能存在一种立体阻断机制，可能有效阻碍胆固醇的内化。总的来说，这些发现提供了有力的分子证据，表明选定的植物来源多酚可以稳定NPC1L1在抑制构象中，破坏胆固醇运输动力学，并在关键生物物理参数上优于临床使用的抑制剂依折麦布。这项研究为开发基于多酚的NPC1L1抑制剂作为下一代降胆固醇疗法奠定了坚实的计算基础。虽然研究假设多酚可以作为NPC1L1的潜在抑制剂，但减少的MD模拟仅支持结合亲和力，而不支持总的胆固醇运输机制。此外，研究得出的结论仅基于单个轨迹，不能支持详细的排名或机制解释。

作者贡献声明：
Budheswar Genomics
Budheswar Dehury：写作——审阅与编辑、验证、监督、软件、资源、项目管理、调查、资金获取、概念化。
Shakiba Shah：写作——初稿、方法学、正式分析、数据管理。
Shashank Rao Padubidri：写作——初稿、可视化、软件、方法学、正式分析、数据管理。
Sreelakshmi K V：写作——初稿、方法学、正式分析、数据管理。
Nasri Thaha：写作——初稿、可视化、正式分析、数据管理。
Arun Prasad Pandurangan：写作——审阅与编辑、可视化、监督、软件、资源、方法学、调查、正式分析、数据管理。

未引用的参考文献：35.; 55.

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利益冲突声明：作者声明没有利益冲突。