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本文系统评述了植物免疫核心蛋白——核苷酸结合富亮氨酸重复序列（NLR）蛋白的高阶结构组装。文章深入剖析了CNL与TNL两类NLR如何通过形成“抗病小体”（resistosome），包括多聚复合体、纤维状结构和生物分子凝聚体，来执行钙离子通道功能（如ZAR1、Sr35、WAI3、NRC）或烟酰胺腺嘌呤二核苷酸酶（NADase）活性（如RPP1、ROQ1），从而启动效应子触发免疫（ETI）。综述整合了近年冷冻电镜结构解析的突破性进展，揭示了NLR从自抑制到激活态的构象变化、不同寡聚体（四、五、六、八聚体）的形成机制及其在信号转导中的核心作用，并对NLR网络的调控、病原体效应子对抗策略及未来作物抗病育种的结构指导方向进行了展望。
植物先天免疫的守卫者：NLR蛋白概述
植物固着生长，不断面临环境中多种病原体的侵袭。它们缺乏适应性免疫系统，完全依赖先天免疫来抵御病原体入侵。植物先天免疫主要分为模式触发免疫（PTI）和效应子触发免疫（ETI）。ETI由细胞内抗性（R）蛋白介导，其中绝大多数是核苷酸结合富亮氨酸重复序列（NLR）蛋白。NLR蛋白通常包含三个模块：N端结构域、核苷酸结合适配器（NB-ARC）结构域和C端富亮氨酸重复序列（LRR）结构域。根据N端结构域的不同，NLR主要分为卷曲螺旋（CC）-NLR（CNL）和Toll/白细胞介素-1受体（TIR）-NLR（TNL）两大类。此外，根据功能可分为直接或间接识别效应子的“传感器NLR”和接收传感器信号并最终触发细胞死亡的“辅助NLR”。
传感器NLR的多样化组装启动免疫
免疫反应启动时，NLR发生构象变化，组装成称为“抗病小体”的高阶寡聚复合体。这种精确的结构重排使得N端结构域通过关键残基的空间聚集，发挥离子通道或活性酶的功能。近年来冷冻电镜技术的进展，以高分辨率解析了多种寡聚复合体的结构，揭示了不同NLR亚型如何通过形成高阶结构来启动免疫应答。
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Singleton MADA型CNL形成五聚体抗病小体：拟南芥的ZAR1是首个结构被解析的植物CNL抗病小体。在静息状态，ZAR1与RKS1形成异源二聚体，处于自抑制构象。当感知到病原体效应子AvrAC对宿主蛋白PBL2的尿苷酸化修饰后，PBL2UMP与ZAR1-RKS1复合体结合，诱导NB-ARC结构域构象变化，促使ADP交换为ATP，最终组装成轮状五聚体抗病小体。该抗病小体的CC结构域形成一个高度酸性的通道，插入质膜，作为钙离子可渗透的阳离子通道。类似地，小麦抗病蛋白Sr35直接识别效应子AvrSr35，也形成五聚体抗病小体，发挥钙离子通道功能。
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CCG10型CNL形成八聚体抗病小体：系统发育上独特的CNL分支CCG10-NLR（如WAI3、RPS2）组装成八聚体抗病小体。与ZAR1和Sr35不同，它们缺乏保守的EDVID基序，使得NB-ARC结构域可以围绕与CC结构域的铰链大幅旋转，形成延伸的j形构象。活化的八聚体WAI3抗病小体同样具有钙通道活性。有趣的是，WAI3还能进一步形成双八聚体组装体。
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TNL形成四聚体抗病小体发挥NADase活性：与CNL抗病小体通过通道活性促进离子流不同，TNL抗病小体（如RPP1、ROQ1）的TIR结构域在寡聚化后被激活，发挥酶学功能。它们通过LRR和C-JID结构域识别效应子，发生构象变化，导致NB-ARC结构域四聚化。这种四聚化将TIR结构域重新定位在紧密接近的位置，形成不对称的四聚体，并在其二聚界面产生催化位点。TNL四聚体抗病小体显示出完整的NADase活性，水解NAD+产生多种NAD+衍生物作为第二信使。
辅助NLR的多样化组装驱动免疫激活
许多传感器NLR需要辅助NLR来完全传导信号并执行细胞死亡。主要的辅助NLR家族包括N-requirement gene 1（NRG1）和activated disease resistance 1（ADR1），它们参与TIR组装体的下游信号传导。这两种蛋白都属于RNL。它们与脂酶样蛋白enhanced disease susceptibility 1（EDS1）协同工作，EDS1与phytoalexin deficient 4（PAD4）或senescence-associated gene 101（SAG101）形成特异性复合物来介导免疫信号。TIR组装体产生的NAD+衍生物与EDS1复合物结合，诱导其构象变化，使其能够与NRG1或ADR1结合，从而促进这些辅助NLR的寡聚化。寡聚化的RNL定位于质膜，发挥钙离子通道功能。
另一种独立于EDS1复合物的辅助CNL被称为“NLRs required for cell death（NRC）”，存在于茄科植物中。与典型的单体CNL形成五聚体不同，NRC（如NRC2、NRC3、NRC4）形成六聚体抗病小体。这些六聚体处于激活态，可驱动钙离子内流激活免疫。有趣的是，NRC在异源系统（如动物细胞）中无法自主诱导钙离子内流或细胞死亡，暗示其完全激活可能需要其他植物成分的参与。
为防止不必要的免疫反应，细胞进化出多种机制来调控NRC功能。结构研究表明，NRC能以多种多聚体形式存在，例如SlNRC2可形成同源二聚体、四聚体甚至更高级的丝状结构，这些形式被认为是非活性状态，通过LRR-LRR和LRR-CC相互作用将信号传导CC结构域隔离起来，起到自抑制作用。NRC的激活信号来自多种不同的传感器NLR（如Rx、Bs2、Sw5b），传感器NLR可能通过其暴露的、处于特定核苷酸结合状态的NBD表面，与辅助NRC的NBD发生瞬时相互作用，从而触发NRC的寡聚化。
病原体也进化出靶向辅助NLR组装过程的策略以抑制免疫。例如，效应子SS15结合NRC的HD1结构域，阻止其寡聚化；效应子AVRcap1b与NRC的中间寡聚态结合，掩盖其进一步寡聚化的界面。宿主内在的负调控因子，如缺乏N端区域的NRG1C，可以通过与EDS1-SAG101复合物更高的亲和力竞争性结合，形成无活性的复合物，从而抑制功能性辅助NLR1A/NRG1B的作用。
免疫蛋白的丝状组装调控免疫反应
某些植物NLR可以组装成丝状结构。例如，SlNRC2在高浓度下可形成由三个原丝螺旋缠绕而成的丝状结构，其中包含其二聚体和四聚体非活性形式，表明丝状SlNRC2也处于非活性状态，这种丝状形成可能是NRC家族某些成员的一种调控策略。
一些植物TIR结构域在双链DNA（dsDNA）或RNA（dsRNA）存在下也能组装成丝状结构。例如，亚麻L7的TIR结构域（L7TIR）在dsDNA/RNA介导下形成两条原丝。有趣的是，L7TIR的酶活性似乎受其组装模式调节。其低分子量寡聚形式表现出NADase活性，而丝状形式中的TIR结构域对称排列，缺乏NADase活性，但显示出2‘，3’-cAMP/cGMP合成酶活性，可利用从结合的dsDNA/RNA水解的核苷酸。当破坏其丝状形成界面但不改变催化残基时，L7TIR保留NADase活性但失去合成酶活性，表明这两种酶活性是可分离的，寡聚化模式可切换这两种活性。
丝状形成似乎是不同界域调控免疫反应的通用策略之一。动物NLR的N端PYD和CARD结构域可自寡聚成丝，分别作为炎症小体组装的成核位点和招募caspase-1的平台。其他含TIR结构域的免疫蛋白，如CRISPR相关TIR蛋白1（Cat1）、SARM1等，也在组装成丝状结构时表现出NADase活性。与植物L7TIR丝在核酸支架上形成对称组装发挥合成酶功能不同，这些具有NADase活性的TIR丝通常采用不对称的头尾排列，这对于形成催化NADase活性的复合活性位点至关重要。
免疫蛋白的生物分子凝聚体实现高效免疫反应
生物分子凝聚体是一种无膜细胞器，通过液-液相分离（LLPS）形成，能够通过内部区室化高效、选择性地调控生化反应。近期研究表明，植物NLR相关蛋白可通过形成生物分子凝聚体被精细调控。
例如，RPP1的TIR结构域（RPP1TIR）以及TIR-only蛋白RBA1和TX14，在NAD+和ATP等底物存在下能在体外形成相分离凝聚体。本氏烟TIR-only蛋白NbSTIR1在体内与抑制蛋白NbISIC1形成无活性复合物，细胞质钙离子内流可释放NbISIC1的抑制，使得NbSTIR1能够形成对其NADase活性和触发细胞死亡至关重要的凝聚体。这种钙离子依赖的抑制释放机制在植物物种间似乎是保守的。此外，完整的TNL蛋白DM2h/RPP1也能在细胞核内与其免疫触发伙伴DM3Hh-0存在下形成凝聚体。
免疫信号中枢EDS1/PAD4复合物也能在SA诱导下与宿主调控因子如NPR1、SMA1形成生物分子凝聚体，分别称为SINC和SMNC，在细胞质和细胞核中精细调控TIR/TNL信号传导。此外，RPM1互作蛋白4（RIN4）也在质膜形成纳米级凝聚体，促进其被RIPK磷酸化，从而激活免疫反应。病原体效应子XopR可侵入并破坏RIN4凝聚体，损害免疫反应，表明相分离为免疫蛋白功能提供了有利环境，而病原体也协同进化以靶向这些凝聚体。
生物分子凝聚体和丝状结构在组织上特性不同，但近期研究表明它们紧密关联。凝聚体可通过增加亚基的局部浓度，促进其向另一种寡聚形式（如丝状形成）转变。
结论与展望
过去十年，植物NLR蛋白的结构解析为了解其作用模式提供了关键见解，但仍有诸多问题有待阐明，例如传感器NLR如何精确诱导辅助NLR寡聚化，哪些植物因子介导执行细胞死亡的抗病小体插入质膜，以及RNL如何寡聚形成最终抗病小体。此外，对NLR非活性态的结构了解仍然有限。尽管存在多种NLR，但结构信息仅限于一个子集，这很大程度上源于其固有的构象动态特性。未来的研究需要克服样品制备的挑战，例如更多利用植物体内表达的蛋白进行结构分析。
一些NLR含有非典型的N端结构域（如α-β水解酶结构域或蛋白激酶结构域），它们在植物免疫反应中的功能和角色尚完全未知。目前所有可用的NLR结构都是同源寡聚体，但许多其他NLR以异源配对形式起作用，或与非NLR蛋白共同作用以触发免疫反应。利用冷冻电子断层扫描（cryo-ET）对植物NLR进行原位结构分析，将可能提供关于NLR结构与组织的全面理解。
理解NLR蛋白的结构不仅为了解植物免疫机制提供了宝贵见解，也使我们能够改造NLR以培育具有增强抗病性的作物。基于结构洞察对NLR高阶组装（不）相容性进行精细调控，可以调整其激活阈值，用于基因组预测平台，防止杂交坏死，并指导替换不兼容的NLR残基以克服育种中的组合障碍。此外，结构表征NLR的效应子结合表面，有助于设计改造以扩大对进化病原体的识别范围，或设计能够逃逸病原体介导抑制的NLR。这些基于结构的策略为开发具有精准可控免疫激活和增强抗病性的作物提供了框架。植物NLR介导的免疫激活比目前已知的更为复杂，未来利用结构和生物化学方法的研究有望阐明植物免疫中遗留的问题。
