菜豆（Phaseolus vulgaris）中的ROP GTP酶为它们在根瘤菌（Rhizobium tropici）与核盘菌（Sclerotinia sclerotiorum）相互作用中的作用提供了证据

《Physiological and Molecular Plant Pathology》：ROP GTPases in Phaseolus vulgaris provide evidence of their roles in Rhizobium tropici and Sclerotinia sclerotiorum interactions

本研究探讨了豌豆（Phaseolus vulgaris）在根瘤菌共生和真菌病原体感染下的Rho蛋白GTP酶（ROP）基因调控机制。通过接种Rhizobium tropici和Sclerotinia sclerotiorum，观察到根瘤发育伴随植株生长抑制及光合色素增加，而真菌感染导致叶片枯萎。RNA测序分析显示，11个ROP基因在不同互作阶段表达动态变化，如PvROP5、8、10在共生早期上调，参与感染线程形成；PvROP1、3、7、10在抗病中显著激活。结构分析将PvROP分为五类，其中某些基因通过调控细胞骨架和信号通路影响共生与抗病平衡。

　　

尤哈娜·贾内莉·阿吉拉尔-古铁雷斯（Yujana Janely Aguilar-Gutiérrez）|安娜·伊莎贝尔·查韦斯-马丁内斯（Ana Isabel Chávez-Mártinez）|黛西·珍妮特·帕拉西奥斯-马丁内斯（Daisy Janet Palacios-Martínez）|梅丽娜·洛佩兹-迈耶（Melina López-Meyer）|贝尔塔·阿丽西亚·莫拉-卡隆（Bertha Alicia Mora-Carlón）|瓜达卢佩·阿琳·莫拉-罗梅罗（Guadalupe Arlene Mora-Romero）|路易斯·卡德纳斯（Luis Cárdenas）|路易斯·赫拉尔多·萨米恩托-洛佩兹（Luis Gerardo Sarmiento-López）

墨西哥锡那罗亚州洛斯莫奇斯地区自治大学（Universidad Autónoma de Occidente）环境与健康研究单元，邮编81223

摘要

根瘤共生和病原真菌感染代表了两种截然不同的生物相互作用，它们影响着Phaseolus vulgaris的生长，并需要精确的细胞重编程。接种Rhizobium tropici后，根瘤器官逐渐形成，在接种后21天和30天时达到根瘤数量和直径的最大值。这一发育过程伴随着植株高度、叶片和根系重量的显著减少，同时光合色素含量增加，这与共生建立的能量需求一致。相比之下，由坏死性真菌Sclerotinia sclerotiorum引起的感染会导致叶片大面积坏死和严重的病害，证实了P. vulgaris的易感性。为了探究与这些过程相关的分子调控因子，在P. vulgaris基因组中基于Ras超家族结构域（PF00071）和Rho特异性序列（PS51420）鉴定了11个ROP（Rho of Plants）GTP酶基因。结构和系统发育分析将PvROPs分为五个保守的亚家族，而启动子分析揭示了与根瘤形成（OSE1ROOTNODULE和OSE2ROOTNODULE）和免疫信号传导（WRKY710S）相关的顺式调控元件，表明存在依赖具体情境的转录调控。表达分析表明，PvROPs对这两种相互作用都有动态响应：在共生初期（7天时），PvROP5、PvROP8和PvROP10显著上调，表明它们参与感染丝的形成和初始根瘤信号传导；而在21天时，PvROP1、PvROP7和PvROP9上调，可能促进根瘤成熟和功能发挥。相反，在被S. sclerotiorum感染的叶片中，PvROP1、PvROP3、PvROP7和PvROP10强烈表达，提示它们可能在植物防御反应中发挥作用。我们的研究结果为理解PvROPs在P. vulgaris中平衡病原性和共生性相互作用的作用提供了重要见解。

引言

植物不断面临生物和非生物胁迫，这些胁迫影响其生长、发育和生存。其中，与微生物的相互作用（无论是有益的还是有害的）在植物适应和生产力中起着重要作用。无论是互惠共生（如根瘤共生）还是病原感染（如真菌感染），都需要高度协调的分子感应和信号传导系统，使植物能够感知微生物并激活适当的适应反应[1]。在豆科植物-根瘤菌共生过程中，植物根部分泌黄酮类物质，诱导根瘤菌表达结瘤基因（nod基因），从而合成Nod因子（脂质寡糖）。这些Nod因子被根表皮中的特异性受体样激酶识别，激活涉及钙信号传导和核相关激酶的细胞内信号级联[2]。这种信号传导触发皮层细胞分裂和感染丝的形成，最终形成根瘤，根瘤菌在其中分化为能够固定大气氮的细菌体[3]。同样，在与植物病原真菌（如坏死性叶真菌）的相互作用中，植物激活受体介导的信号通路，引发防御反应、细胞重编程以及专门的感染或防御相关结构的形成[4]。在共生和病原情况下，植物都需要大幅增加质膜的产生和重塑，以支持这些相互作用界面的形成和维持。这些过程依赖于动态的膜运输机制，包括内吞作用和外排作用，这些过程调节受体的更新、信号传播以及蛋白质和脂质的定向传递[5]。

小GTP酶（鸟苷核苷酸结合蛋白），也称为单体GTP结合蛋白，是高度保守的专门信号通路的关键调节因子[6,7]。尽管共生和病原过程的结果截然不同，但它们依赖于重叠的调控框架，其中小GTP酶在组织膜相关信号传导和结构响应中起关键作用。Ras超家族是一类主要的小GTP酶蛋白，分为五个亚家族：腺苷二磷酸核糖化因子、脑部相关RAS蛋白、RAS相关核蛋白（RAN）、鼠肉瘤蛋白（RAS）和Ras同源物（RHO）[8]。有趣的是，植物拥有一种独特的亚家族——Rho of Plants（ROP），它在系统发育上与其他Ras超家族成员不同，仅存在于植物中[8]。ROP蛋白的结构由催化G结构域内的五个保守G-box基序定义。其中，G1（GXXXXGKS/T）、G3（DXXGQ/H/T）、G4（T/NKXD）和G5（C/SAK/L/T）基序对GTP/GDP结合和GTP水解至关重要，而G2（T）基序作为与下游效应蛋白相互作用的效应结构域。此外，高度可变的C末端区域经过翻译后脂质修饰，将ROPs分为两大类：I型ROP含有CaaL基序，其末端半胱氨酸残基被链烷基化；II型ROP含有GC-CG基序，其半胱氨酸残基被S-酰基化。这些脂质修饰以及富含精氨酸和赖氨酸的近端多碱性区域对于ROP与质膜的结合至关重要，这是激活的ROP启动下游信号传导的主要场所[9]。ROP GTP酶在调节多种生理过程中起重要作用，并且也参与了植物与微生物的相互作用，包括对病原体的防御反应和共生过程中的信号传导[10],[11],[12],[13]。多项植物研究表明，ROP/RAC GTP酶在调节植物免疫反应中起关键作用，尽管其效应因物种和病原体而异。在Arabidopsis thaliana中，AtRAC7/ROP9和AtROP6通过调节防御相关基因表达、细胞壁结构和活性氧（ROS）反应来增强对真菌病原体的抗性[14,15]。在马铃薯中，过表达AtROP1或StRAC1可增强对Phytophthora infestans的抗性[11]。同样，从Solanum habrochaites克隆的ShROP7被证明是抗白粉病的正向调控因子[16]，而大麦（Hordeum vulgare）的同源物HvRACB、HvRAC3和HvROP6则与对Blumeria graminis引起的白粉病的易感性增加有关[17]。在稻米（Oryza sativa）中，几种RACs（包括OsRac4、OsRac5、OsRac6和OsRac1Magnaporthe grisea的免疫反应中起关键作用[18]。最近的研究表明，Fragaria vesca中的ROP4通过与RbohF的相互作用促进ROS的产生，从而增强对B. cinerea的抗性[19]。在Mesorhizobium loti感染过程中，Lotus japonicus中的ROP6被确定为感染丝进展的关键介质[10]；此外，在Lotus japonicus中，SPIKE1在ROP6上游发挥作用，整合细胞外信号以促进根毛发育和根瘤菌定植期间的感染丝形成[20]。在接种Sinorhizobium meliloti的M. truncatula中，过表达ROP10通过诱导根毛变形改变了根瘤菌感染和根瘤发育[21]。同样，在Glycine max中，ROP9被GEF2激活，增强了与Bradyrhizobium japonicum的共生关联[22]。

比较基因组分析表明，不同植物物种中的ROP GTPase基因家族大小存在显著差异：A. thaliana中有11个基因，O. sativa中有8个，Z. mays中有9个，L. japonicus中有8个，M. truncatula中有7个，G. max中有20个，H. vulgare中有6个，M. domestica中有18个，P. bretschneideri中有9个，R. rugosa中有6个，R. occidentalis中有6个，P. persica中有7个，F. vesca中有7个，S. tuberosum中有11个[12],[17],[18],[19],[23],[24],[25],[26]。

Phaseolus vulgaris是一种重要的豆科植物，是蛋白质和微量营养素的主要来源，但其产量常受到坏死性真菌Sclerotinia sclerotiorum的限制，这种真菌会导致白霉病，并通过长期存在的菌核在土壤中持续存在，导致整个生长周期内的反复感染。同时，P. vulgaris与根瘤菌建立互惠共生关系，形成根瘤以进行生物固氮。本文研究了ROP GTP酶在抵抗S. sclerotiorum感染和与根瘤菌共生过程中的双重作用，分别在结瘤和病原感染条件下进行了研究。此外，还分析了P. vulgaris中的ROP GTPase基因家族，并在根瘤菌和S. sclerotiorum相互作用期间检测了这些基因的表达。本研究的假设是，与根瘤菌的共生和S. sclerotiorum的感染分别以不同的方式调节ROP GTP酶的活性，导致在叶片感染和根系定植过程中不同ROP基因的特异性参与。这种方法旨在阐明ROP GTPase基因家族的作用，特别关注它们在调节病原性和共生相互作用中的作用。

实验设计

结瘤实验的设计

使用由墨西哥锡那罗亚州胡安·何塞·里奥斯（Juan José Ríos）的INIFAP Valle del Fuerte实验站Elizabeth García León博士提供的P. vulgari Azufrado Higuera品种的种子，并按照Cardenas等人的方法进行表面灭菌[27]。选择该品种是因为它在锡那罗亚地区的重要性，代表了该地区农业生产系统中重要的P. vulgaris类型。灭菌后的种子放置在浸有Fahraeus溶液的湿纸巾覆盖的无菌钢板上

与结瘤相关的形态和生理反应

为了评估根瘤共生，我们在接种了R. tropici的P. vulgaris植物中进行了时间进程实验，并在接种后7天、14天、21天和30天进行采样（图1）。总体而言，接种组（Nod⁺）的植株高度低于未接种组（Nod^?）（图1a）。显微镜观察P. vulgaris的根系显示了共生结构的有序发育：7天时出现根瘤原基，14天时出现未成熟根瘤，21天时出现成熟根瘤，30天时出现衰老根瘤

讨论

结瘤是一个高度有序的生物固氮过程，依赖于根瘤菌和宿主豆科植物之间分子信号识别和转导的精确协调[45]。在结瘤过程中，早期阶段的感染丝形成和后期阶段的菌体膜分化都需要宿主植物提供大量的碳和能量资源[24,46,47]。另一方面，与

结论

总之，本研究表明，接种R. tropici促进了P. vulgaris的根瘤发育，并伴随着共生关系的建立。在接种后21天和30天时，根瘤数量和直径达到最大值。这些共生阶段伴随着植株生长和生物量的暂时减少，以及光合色素含量的显著增加，反映了根瘤菌感染和根瘤形成所需的高能量消耗

资助

本研究得到了加强研究和研究生教育机构计划（Programa Institucional para el Fortalecimiento de la Investigación y el Posgrado，简称PIFIP2024-10）的支持。Bertha Alicia Mora Carlón和Yujana Janely Aguilar-Gutiérrez感谢科学、人文、技术及创新部（Secretaría de Ciencia, Humanidades, Tecnología e Innovación，CVU编号分别为1072032和2165833）的支持。Daisy Janet Palacios-Martínez（CVU编号299895，奖学金编号2342655）和Ana Isabel Chávez-Martínez（CVU编号559622，奖学金编号4057713）也表示感谢

CRediT作者贡献声明

尤哈娜·贾内莉·阿吉拉尔-古铁雷斯（Yujana Janely Aguilar-Gutiérrez）：负责撰写、原始稿件撰写、方法学设计和研究。安娜·伊莎贝尔·查韦斯-马丁内斯（Ana Isabel Chávez-Mártinez）：负责验证、方法学设计、数据整理。黛西·珍妮特·帕拉西奥斯-马丁内斯（Daisy Janet Palacios-Martínez）：负责验证、研究设计、数据整理。梅丽娜·洛佩兹-迈耶（Melina López-Meyer）：负责撰写、审稿与编辑、方法学设计。贝尔塔·阿丽西亚·莫拉-卡隆（Bertha Alicia Mora-Carlón）：负责撰写、审稿与编辑、可视化处理、方法学设计。瓜达卢佩·阿琳·莫拉-罗梅罗（Guadalupe Arlene Mora-Romero）：负责撰写、审稿与编辑、可视化处理、方法学设计。路易斯·卡德纳斯（Luis Cárdenas）：负责撰写、审稿与编辑、可视化处理、验证。

生成式AI声明

声明：在准备本工作时，作者使用了ChatGPT来辅助语法检查和提高英文表达的清晰度。使用该工具后，作者对内容进行了必要的审查和编辑，并对发表文章的准确性和完整性承担全部责任。

利益冲突声明

作者声明没有已知的财务利益冲突或个人关系可能影响本文的研究结果。

致谢

作者特别感谢Luis Roberto Sánchez Parra和Octavio Ernesto Martínez Ereva提供的宝贵技术支持。