胫骨软骨发育不良引起的肠道微生物群失衡会通过肠道-骨骼轴加速肉鸡的疾病发生过程

《Powder Technology》：Gut Microbiota Dysbiosis Induced by Tibial Dyschondroplasia in Turn Accelerates Disease Pathogenesis through the Gut-Bone Axis in Broilers

　　霍龙松|王家伟|郝永波|李晓冉|严世佳|韩少阳|赵家豪|韩玉晨|孙硕|陈星|Mhd Adanan Purba|陈辉|李崇
河北农业大学动物科学与技术学院，保定071000，中国

**摘要**
胫骨软骨发育不良（TD）是肉鸡中一种常见且具有经济意义的骨骼疾病，其特征是未矿化的、无血管的软骨块突入口周区域。尽管有一些证据表明肠道微生物群与骨骼疾病有关，但TD发病机制的具体微生物驱动因素仍不清楚。在这项研究中，我们对健康肉鸡和TD模型肉鸡进行了粪便微生物群移植，以评估肠道微生物群失调对TD发病机制的影响和贡献。肉鸡被分为4组：CON（正常对照组肉鸡）、TD（TD模型肉鸡）、TDRN（接受来自正常肉鸡FMT的TD模型肉鸡）和NRTD（接受来自TD模型肉鸡FMT的正常肉鸡）。结果表明，FMT成功地将TD表型从患病肉鸡转移到了健康肉鸡中（NRTD组），而来自健康供体的移植未能逆转TD肉鸡的TD表型（TDRN组）。这在一定程度上表明肠道微生物群是重要的致病驱动因素。微生物组分析显示，在所有TD受影响的组别（TD、TDRN、NRTD）中，乳酸菌显著减少，而链球菌和埃希氏菌-志贺菌则富集（P < 0.05）。代谢组学分析鉴定出7种稳定失调的代谢物。其中，chenodeoxycholic酸与乳酸菌丰度和胫骨矿物质含量呈强烈正相关，而2-甲氧基雌二醇（一种雌激素代谢物）则呈负相关。总体而言，这些发现提供了证据，表明肠道微生物群失调在因果上促进了TD的发生，并将乳酸菌-chenodeoxycholic酸轴和雌激素代谢确定为预防和管理肉鸡TD的有希望的目标。

**引言**
胫骨软骨发育不良（TD）首次于1965年在肉鸡中被描述（Leach等人，1965年），是一种普遍存在且具有经济影响的骨骼疾病，其特征是胫骨发育缺陷，表现为未矿化的软骨块和跛行。最近的流行病学数据显示，商业肉鸡生产中的发病率约为1%（Liu等人，2023b）。主要病理表现包括胫骨生长板近端的血管化受损、软骨细胞异常增生以及软骨内骨化失败，最终形成不透明、无血管且未矿化的软骨肿块（Nawaz等人，2023年）。类似的软骨骨骼异常在多种物种中都有观察到，包括猪、马、牛、狗、兔子和人类，其中被称为软骨发育不良（Faienza等人，2021年；Engiles等人，2022年；Corbeau等人，2024年；Bendre等人，2025年）。复杂的病因使得传统的单一目标治疗策略效果不佳，导致家禽产业利润大幅下降和动物福利受损。因此，探索有效缓解TD的新治疗方法并阐明其机制是当务之急。经过多年的研究，TD模型的技术已经相当成熟。目前，给肉鸡喂食噻硫胺可以有效地诱导TD的发生（Zhang等人，2019年；Amini等人，2026年），这有助于对该疾病的研究。

肠道微生物群越来越被认为是骨骼发育的关键调节因子。通过多种相互关联的途径，肠道微生物群失调会破坏骨骼形成和重塑的过程，包括肠道屏障的损伤（Wu等人，2023年；Yin等人，2024年）、免疫失调（Moon等人，2023年；Li等人，2024年）、代谢紊乱（Zhang等人，2022b年；Liu等人，2023a年；Zhou等人，2024b年；Yu等人，2025年）、营养吸收和利用受损（Elmassry等人，2020年；Ibrahim等人，2022年；Wang等人，2024年）以及内分泌信号传导紊乱（Guan等人，2023年）。通过粪便微生物群移植（FMT），可以双向调节肠道微生物群；它可以用来转移失调的微生物群并再现疾病表型，或者引入健康的微生物群并恢复生理平衡（Xu等人，2023年；Ma等人，2025年）。先前的研究已经广泛探讨了微生物在这种疾病中的作用，证明微生物群影响骨骼发育（Zhang等人，2022a年；Zhang等人，2022c年；Zhou等人，2024a年）。然而，我们对TD发病机制和治疗机制的理解仍存在显著差距。鉴于TD的多因素性质和传统单一模式疗法的效果有限，本研究旨在使用基于干预的筛选方法识别驱动TD发病的具体肠道微生物群和差异代谢物。通过将FMT与多组学分析相结合，我们阐明了TD中的微生物-代谢-骨骼轴相互作用。这些发现有望推进骨骼-微生物相互作用的基本知识，并确定对疾病进展起决定性作用的关键代谢物，从而为TD的预防和治疗策略提供新的目标。

**材料与方法**

**伦理声明**
所有涉及动物的实验程序均经过河北农业大学（保定，中国）动物护理和使用委员会的审查和批准（方案编号：2025117）。该研究遵循ARRIVE指南，并按照英国《1986年动物（科学程序）法》和欧盟指令2010/63/EU进行。

**实验动物和材料**
共获得216只一天大的Cobb 500雄性肉鸡，来自九兴农牧发展有限公司（保定，中国）。四甲基噻硫胺（噻硫胺，纯度≥98%）从硕尔生物技术有限公司（武汉，中国）购买。

**实验设计和FMT**
所有肉鸡都处于定义的光照/黑暗周期和控制的相对湿度（60–70%）下，温度从第1天的35°C逐渐降低到第21天的23°C，之后保持不变，并提供水和食物。所有肉鸡在任何实验程序之前都适应了饲养条件。基础日粮的配方（表1）遵循中国肉鸡饲养标准（NY/T 33-2004）。

**表1. 基础肉鸡日粮的成分和营养组成**
项目 | 启动期（1–21天）
------ | --------
玉米 | 55 |
大豆粕（46% CP） | 30 |
玉米麸皮粕（60% CP） | 34.9 |
大豆油 | 33.0 |
L-赖氨酸 | 2.5 |
DL-蛋氨酸 | 3.4 |
石灰石 | 12.6 |
CaHPO4 | 19.3 |
NaCl | 3.0 |
氯化胆碱 | 2.0 |
维生素预混剂 | 10.3 |
矿物质预混剂 | 11.0 |
沸石粉 | 1.7 |
二氧化钛 | 224.0 |
总计 | 1000 |

**营养浓度**
1. 代谢能（MJ/kg） | 12.45 |
粗蛋白 | 217.8 |
钙 | 10.1 |
可用磷 | 4.5 |
总磷 | 6.9 |
赖氨酸 | 11.4 |
蛋氨酸 | 4.9 |
蛋氨酸+半胱氨酸 | 8.3 |
苏氨酸 | 7.7 |

预混剂每千克日粮提供以下成分：维生素A 10,000 IU，维生素D3 2000 IU，维生素E 10 IU，维生素K3 2.5 mg，维生素B1 1 mg，维生素B2 6 mg，维生素B3 10 mg，维生素B5 40 mg，维生素B6 3 mg，维生素B11 0.3 mg，维生素B12 0.01 mg，生物素 0.12 mg，铜（硫酸铜）8 mg，铁（硫酸亚铁）80 mg，锰（硫酸锰）60 mg，锌（硫酸锌）40 mg，硒（亚硒酸钠）0.15 mg，碘（碘化钾）0.35 mg。
2. 二氧化钛4克与20克磨碎的玉米混合制成。

**实验分组**
共216只健康肉鸡随机分为4组（每组54只，每组9个饲养笼，每笼6只）：
CON（正常对照组）和NRTD（正常肉鸡转为TD组）：肉鸡接受正常日粮；
TD（TD模型组）和TDRN（TD恢复组）：肉鸡从出生后第4天到第7天接受添加了100 mg/kg体重噻硫胺的正常日粮以诱导TD。这种双向FMT设计有助于评估TD从患病肉鸡向健康肉鸡的传播性以及健康微生物群对已建立TD的潜在治疗效果（Xu等人，2023年）。从第10天开始，每天早上7:00在喂食后15分钟内从CON组和TD组收集新鲜的粪便样本（20 mL）。粪便样本悬浮在含有10%甘油的无菌预冷磷酸盐缓冲液（PBS）中。样本以1:1体积比混合并 vortex 20秒以确保充分均匀。然后，将均匀的细菌悬浮液通过无菌不锈钢滤网（0.25毫米）过滤，并通过口服灌胃给予受体肉鸡。TDRN组的肉鸡接受来自CON组的细菌悬浮液，而NRTD组的肉鸡接受来自TD组的细菌悬浮液。连续7天内，受体肉鸡每天接受3 mL粪便微生物群溶液的口服灌胃。作为对照，CON组和TD组的肉鸡在同一时期接受3 mL无菌生理盐水的灌胃。

**生长表现和粪便评分**
肉鸡饲养至21天大，这是骨骼快速发育和TD症状显现的关键时期。经过12小时禁食（保持供水）后，称量每个饲养笼中的肉鸡体重，以确定每笼的平均最终体重作为实验单位。每天测量每笼的饲料摄入量，并收集和称量溢出的饲料以确保准确的消费数据。生长表现参数（包括平均日增重（ADG）、平均日饲料摄入量（ADFI）和饲料转化率（FCR）使用标准公式计算。

**生长表现参数计算**
ADG（g/day）= （最终体重 - 初始体重）/ 期间天数
ADFI（g/day）= 总饲料摄入量 / 期间天数
FCR = 总饲料摄入量 / （最终体重 - 初始体重）

**粪便评分**
按照Hongyu Feng等人（2024年）的程序，在FMT后第20天（Feng等人，2024年）进行粪便评分。当天，在喂食后30分钟内收集粪便样本，并使用5级评分标准进行评分（1 = 正常、成形良好的粪便；2 = 软但成形的粪便；3 = 凝胶状、不成形的粪便；4 = 半液态粪便；5 = 水样、液态腹泻）。

**样本收集**
在21天大时，从每个处理组中随机选择9只体重相当的肉鸡。无菌采集翼静脉血液，4°C下3000 × g离心10分钟，然后收集上清液，放入无菌试管中，迅速冷冻在液氮中，并储存在-80°C用于血清代谢组学分析。

**胫骨参数**
使用灵敏度为0.001克的分析天平测量胫骨重量。使用数字卡尺测量胫骨长度。使用小型动物双能X射线吸收仪（iNSiGHT VET DXA，Osteosys Co., Ltd.，韩国）测量胫骨矿物质密度和矿物质含量。

**组织病理学分析**
胫骨样本在4%福尔马林溶液（pH 7.4）中固定48小时，在室温下进行，然后在10% EDTA溶液（pH 7.4）中脱钙（每48小时更换一次），直至完全脱钙（通过针刺测试验证，通常需要14-21天）。随后，样品在一系列乙醇中脱水，用二甲苯清洗，使用全封闭组织处理器（ASP300S，Leica Biosystems，Buffalo Grove，IL，美国）包埋在石蜡中（Miquelestorena-Standley等人，2020年）。然后将石蜡包埋的样品沿矢状面纵向切片，暴露胫骨生长板。最后，通过苏木精和伊红（HE）以及Safranin O染色进行组织病理学检查，以评估病理变化（Thorup等人，2022年）。使用ImageJ软件（ImageJ软件v1.6.0，NIH，Bethesda，MA，美国）测量胫骨生长板的厚度。

**16S rRNA基因测序**
为了确定回肠微生物群的结构，从回肠内容物样本中提取DNA，并通过琼脂糖凝胶电泳评估DNA的质量和完整性。PCR扩增针对细菌16S rRNA基因的V3–V4区域（约330 bp），使用ABI GeneAmp 9700 PCR系统中的TransStart Fastpfu DNA聚合酶。PCR产物使用AxyPrep DNA Gel Purification Kit进行纯化和回收。使用Quantifluor?-ST Blue荧光定量系统（Promega）进行定量，以确定PCR产物浓度，然后根据每个样本的测序体积要求进行比例池化。PCR产物构建为测序文库，在目标区域的外端添加接头序列。最终在MiSeq平台上（根据Illumina协议）进行测序。所得的配对末端（PE）读取数据进行组装、质量控制和过滤。

**广谱代谢组学**
从-80°C冷冻柜中取出血清样本并在冰上解冻后涡旋混合，转移50 μL至离心管中。加入300 μL含有内标的20%乙腈/甲醇提取溶液，涡旋3分钟，4°C下以12,000 r/min离心10分钟。转移200 μL上清液至管中，-20°C孵育30分钟。在相同条件下再次离心3分钟，然后将180 μL上清液转移至注射瓶中用于仪器分析。

**LC-MS检测和数据获取**
使用Waters ACQUITY UPLC HSS T3 C18柱。流动相由超纯水（含0.1%甲酸）和乙腈（含0.1%甲酸）组成。梯度洗脱流速为0.4 mL/min，柱温为40°C。注射体积为2 μL（广谱）或5 μL（非靶向）。数据采集使用了LC-QTOF-MS/MS平台，在信息依赖性采集（IDA）模式下进行非靶向检测；同时，在LC-MS/MS（QTRAP）平台上采用多反应监测（MRM）模式进行广靶标检测的定性和定量分析。数据处理使用了Analyst 1.6.3软件。为了质量控制（QC），通过混合所有样本提取物的等体积来制备QC样品。在仪器分析过程中，每10个分析样品插入一个QC样品以监测重复性。通过叠加不同QC样品的总离子色谱图（TICs）来评估提取和检测的可重复性。对QC样品进行了皮尔逊相关分析以及内标响应变化（CV值）的检测（CV ≤ 15%表示稳定性）。同时，对所有样品的变异系数（CV） also进行了分析。当QC样品中超过75%的物质的CV < 0.3时，表明实验数据具有高度稳定性。代谢物通过PCA和OPLS-DA进行评估。符合VIP ≥1标准且FC≥2或≤0.5的代谢物被归类为差异富集代谢物。对于KEGG通路分析，Fisher精确检验确定的显著性阈值设定为FDR < 0.05。

微生物组数据进一步在Majorbio Bio-Pharm Technology Co., Ltd.的平台上进行了生物信息学分析。除了肠道微生物组外，其他数据使用SPSS软件（SPSS版本26.0；SPSS Inc, IL）进行分析，结果以平均值±标准误（SEM）表示，均值之间的显著差异通过Student's t检验和单向方差分析（one-way ANOVA）来确定。我们使用GraphPad Prism 8（GraphPad Software，美国加利福尼亚州圣地亚哥）生成图表，并认为P < 0.0的结果具有统计学意义。显著性水平用星号表示（*P < 0.05；**P < 0.01；***P < 0.001）。

**结果**

**生长表现、粪便评分和胫骨参数**
生长性能分析（表2）显示，TD、TDRN和NRTD组的最终体重、平均日增重（ADG）和平均每日饲料摄入量（ADFI）较低，但饲料转化率（FCR）和粪便评分高于CON组（P < 0.05）。值得注意的是，NRTD组的粪便评分显著低于TD组（P < 0.05）。

表2. 3周龄肉鸡的生长表现和粪便评分受膳食噻虫胺和粪便微生物群移植的影响。

**讨论**
TD的特征包括骨骼畸形、血管侵袭减少和生长板增厚，这些临床特征最终导致肉鸡失去站立能力（Zhang等人，2022c；Xu等人，2023）。TD组表现出这些典型特征，证实了本研究中TD模型的成功建立。为了探讨肠道微生物群在TD发病机制中的作用，我们采用了粪便微生物群转移（FMT）技术，并结合了生长性能、骨骼参数、组织学评估（HE和Safranin O染色）以及肠道微生物群分析的数据。值得注意的是，从TD模型肉鸡接受FMT的正常肉鸡出现了TD的典型症状，而从正常肉鸡接受FMT的TD模型肉鸡则没有显示出治疗效果。我们的实验方法直接证明了肠道微生物群在TD发病中的因果关系。FMT实验是一个关键的原理验证：将失调的微生物群转移到其他健康的受体中足以诱导出完整的TD表型，而无需外源性噻虫胺的作用。这一结果直接表明肠道微生物群是一个独立的致病因素，超越了简单的关联关系，提示了肠道与骨骼之间的信号传导机制可能存在问题。这代表了从以往的关联观察向因果关系的突破，我们的发现支持通过调节肠道微生物群作为TD干预的新方法。

在正常情况下，肠道微生物群维持着平衡且多样的生态系统，有益细菌占主导地位。肠道微生物群失调指的是肠道微生物群原始结构的改变，表现为有益细菌减少和致病细菌增加（Hou等人，2025）。例如，在感染H9N2禽流感病毒后，肉鸡的肠道微生物群会变得失调，导致肠道机会性病原体增加，并抑制乳酸杆菌等有益细菌的生长（Zhang等人，2020年）；抗生素的过度使用会导致肠道微生物群失衡，从而增加病原菌数量并减少有益细菌（Shi等人，2020年）。在这项研究中，16S rDNA分析显示，与对照组相比，TD组和NRTD组的肠道微生物群结构在属水平上存在显著差异（表现为有益细菌的相对丰度降低和病原菌的相对丰度增加），而且这两个处理组的粪便评分也显著更高。因此，我们得出结论，这两个处理组都发生了肠道微生物群失调。此外，接受FMT的NRTD组比由化学试剂诱导的TD组表现出更明显的微生物群结构改变。鉴于NRTD组观察到的TD症状，我们认为TD的发展与FMT治疗引起的肠道微生物群失调有关。

肠道微生物群在骨骼发育中起着关键作用，微生物群失调与TD的发病机制有关（Hansen等人，2022年；Huang等人，2022年；Xu等人，2023年）。通过比较TD组、NRTD组和对照组的细菌属，我们发现了三个显著不同的属：乳酸杆菌的相对丰度降低，而大肠杆菌-志贺氏菌和链球菌的相对丰度增加。乳酸杆菌作为一种明确的益生菌属，通过多种机制维持正常的肠道功能并促进肠道健康，包括免疫调节、维生素合成以及创造抑制病原体定植的酸性微环境（Hati等人，2019年；Doo等人，2024年；Kuraji等人，2024年）。相比之下，链球菌和致病性大肠杆菌会产生炎症介质和代谢毒素，这些物质可能直接损害软骨细胞功能并阻碍骨骼发育。最近的研究表明，链球菌可以通过促进破骨细胞分化同时抑制成骨细胞活性来诱导骨吸收，这与我们在TD受影响鸟类中观察到的矿化减少一致（Ooi等人，2014年；Noble等人，2020年；Jones，2022年；Sun等人，2024b年）。虽然大多数链球菌属是无害的共生菌，但致病性菌株——特别是粪链球菌——会通过上调破骨细胞生成标志物（c-Fos和NFATc1）同时下调成骨细胞分化（Park等人，2019年；Zheng等人，2024年；Huband等人，2025年）来破坏骨骼稳态。这种破骨细胞和成骨细胞之间的不平衡最终会干扰骨骼发育。这些微生物变化共同导致肠道微环境的恶化，进而引起体内代谢紊乱，最终影响骨骼发育。

为了探讨肠道微生物群失调对肉鸡代谢过程的影响，我们分析了血清代谢组。通过筛选，我们发现了七种表现出显著差异的代谢物：loganin、羟基香豆酸、 Chenodeoxycholic酸、tricarballylic酸、ergothioneine、colforsin daropate和2-methoxyestradiol。肠道微生物群通过多种机制影响胆汁酸代谢：(1) 细菌胆盐水解酶使初级胆汁酸脱轭；(2) 7α-脱氢酶将初级胆汁酸转化为二级胆汁酸；(3) 肠道微生物调节肠肝循环效率；(4) 微生物代谢物调节肝脏胆汁酸合成。在我们TD组中减少的乳酸杆菌是主要的BSH生成者和胆汁酸调节剂（Fibi-Smetana等人，2021年）。它们的缺失会通过减少脱轭作用降低Chenodeoxycholic酸的生物利用度，并可能增加粪便排泄。同时，致病细菌可能会产生直接抑制肝脏FXR表达或竞争FXR结合的代谢物，进一步损害胆汁酸介导的骨骼保护。研究表明，Chenodeoxycholic酸和2-methoxyestradiol影响骨骼生长和发育。Chenodeoxycholic酸是一种用于溶解胆固醇结石的胆汁酸，同时在骨骼发育中起调节作用。作为法尼oids X受体（FXR）的最强激动剂（Clifford等人，2021年；Mori等人，2022年），它通过FXR/RXR异二聚体和ER同二聚体上调Runx2表达，并增强ERK和β-连环蛋白信号通路（Cho等人，2013年；Liu等人，2022年）。这一级联反应促进骨形成标志物如骨桥蛋白和骨钙素的表达，从而加速成骨细胞分化和骨形成（Wang等人，2018年；Absil等人，2020年；Chen等人，2020年；Xiang等人，2023b年）。此外，Chenodeoxycholic酸通过抑制RANKL来降低RANKL/OPG比率，从而抑制破骨细胞的生成（Cho等人，2013年）。2-methoxyestradiol是一种从17β-estradiol内源性产生的促凋亡物质，具有抗血管生成作用，目前正作为抗癌剂进行研究（Samartzis等人，2016年；Hou等人，2023年），它似乎通过双重机制介导TD的发病机制：它同时通过抑制软骨细胞增殖和分化来破坏生长板稳态，并通过抑制破骨细胞来促进成熟软骨细胞的凋亡（Turner等人，2000年；Sibonga等人，2002年；Maran等人，2006年；Cicek等人，2007年；Guan等人，2023年），而肠道微生物群失调引发的2-methoxyestradiol积累（Sun等人，2024a）可能是这些病理过程的潜在上游触发因素。值得注意的是，我们发现血清中2-methoxyestradiol的异常升高与上述微生物变化模式紧密相关。相关性分析表明，Chenodeoxycholic酸和2-methoxyestradiol之间存在显著负相关性（P < 0.05）。前者是一种初级胆汁酸，后者是一种雌激素代谢物，两者都属于类固醇类物质，并由肝脏中枢代谢，肝脏本身受到它们的调节反馈（Qiu等人，2017年；Ren等人，2021年；Dong等人，2025年）。胆汁酸可以通过FXR途径影响激素分泌（Yang等人，2025年），并通过孕烷X受体和固有雄甾烷受体调节雌激素代谢酶（如CYP3A4）的表达，从而阻碍肝脏内的雌激素降解（Kodama等人，2011年；Liu等人，2018年；Li等人，2019年）。相反，激素可以调节胆汁酸代谢。过量的雌激素及其代谢物可导致胆汁淤积，从而导致胆汁流量减少和有毒胆汁酸的积累（Dong等人，2019年；Zu等人，2021年；Alaei Faradonbeh等人，2022年；Xiang等人，2023a）。总之，尽管导致TD的途径多种多样，但我们的实验证据有力地表明，在TD的发病机制中不应忽视涉及肠道微生物群失调及其随后对胆汁酸和雌激素代谢的干扰。

尽管这项研究确定了与肉鸡TD相关的潜在肠道微生物群和代谢物，但仍需承认几个重要限制。首先，由于主要目标是测试FMT本身是否能够重塑肠道微生物群，我们没有使用抗生素预处理来清除受体鸟类的原有微生物群——这可能会影响移植微生物群的定植和功能效果。其次，由于当前的方法学限制，我们只能检测相对丰度较高的微生物分类单元；因此，可能忽略了潜在的低丰度但具有致病性的病原体或菌群。最后，鉴于TD的复杂病因和不计其数的代谢物改变，我们将解释重点放在那些变化最为显著的代谢物上。这些代谢物是否是TD的真实驱动因素，还是次要标志物，需要进一步的实验验证。

FMT成功转移TD表型证实了特定肠道微生物群与骨骼病理学诱导之间的机制联系。我们发现所有TD受影响组中都存在一致的失调特征，表现为乳酸杆菌减少以及链球菌和大肠杆菌-志贺氏菌的富集。这些现象背后的机制集中在胆汁酸代谢失调（特别是Chenodeoxycholic酸水平降低）和抗血管生成剂2-methoxyestradiol的积累上。这些发现为未来肉鸡TD的治疗提供了有希望的策略：(1) 调节肠道微生物群，特别是通过增加乳酸杆菌的数量和抑制机会性病原体；(2) 在饮食中补充Chenodeoxycholic酸；(3) 调节相关代谢以抑制内源性2-methoxyestradiol的合成。

**数据可用性**
肠道微生物群分析数据已存储在NCBI Sequence Read Archive数据库中，访问号为PRJNA1403183。