《ChemistryOpen》：Horse Hoof Trimmings as an Untapped Resource for Sustainable Keratin Utilization
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本文系统探讨了将常规马匹护理中产生的马蹄修剪废弃物，作为一种新型、可再生、无虐待的优质角蛋白（Keratin）来源进行高值化利用的潜力。文章详细综述了其作为硬质α-角蛋白的化学成分、独特的层级结构、物理化学性质及其与营养、环境和管理实践的相关性，并重点评估了角蛋白的绿色提取方法和升级回收策略，指出了其走向工业化应用面临的挑战与机遇。这篇综述旨在激发可持续材料化学、生物聚合物工程和循环资源管理领域的创新，推动绿色与循环化学原则的发展。
引言：被忽视的宝藏——角蛋白与动物废弃物
角蛋白是上皮细胞中最丰富的结构蛋白，也是仅次于胶原蛋白的第二大生物聚合物。它以其出色的机械和生化特性而著称，这些特性源于其由氢键、离子键、二硫键和疏水相互作用稳定的多肽链基础结构。角蛋白富含含硫氨基酸，特别是半胱氨酸（Cysteine, 7-13%），这些氨基酸形成了增强角蛋白稳定性的分子间和分子内二硫键。根据硫含量，角蛋白可分为硬角和软角蛋白；而根据组成和结构，则可分为α-角蛋白、β-角蛋白和非结构性的γ-角蛋白。
动物的不可食用组织是角蛋白的主要来源。目前，大量的角蛋白资源，如羽毛、羊毛、蹄、角等，主要来自肉类工业屠宰和加工操作的副产品。尽管质量上乘、特性独特，这些角蛋白副产物通常被视为废物，需根据法规进行焚烧或填埋处理，这不仅导致温室气体和污染物的排放，也造成了宝贵蛋白质资源的浪费。因此，采用环境可持续的策略对这类废弃物进行高效加工和高值化利用至关重要，这不仅能减少环境污染，还能通过变废为宝提升肉类生产系统的可持续性。
角蛋白凭借其卓越的机械和生物特性、热稳定性、优良的生物降解性和生物相容性以及细胞粘附能力，成为开发生物基材料、功能食品、药品、农产品、纺织品等的理想原材料。其市场需求持续增长，凸显了对替代蛋白质源的迫切需求。
聚焦新来源：马蹄修剪废弃物
在众多角蛋白来源中，马蹄（特别是修蹄产生的修剪物）是一个被长期忽视的宝库。与屠宰来源的材料不同，马蹄修剪物是在常规马匹护理（每月至少一次的修蹄或钉蹄）中产生的，是一种无虐待（Cruelty-free）、可追溯、高质量的角蛋白生物聚合物原料。
与已充分开发的原料（如羽毛、羊毛）相比，马蹄修剪物具有几个关键优势：1) 无虐待性：其产生源于动物福利，不涉及对动物的伤害；2) 高纯度与质量：运动或工作用马的营养、管理和训练都经过优化以保证蹄部健康，这使得其角蛋白含量极高（干基98.24-98.86%），超过了羊毛（约90%）和羽毛（约95%）；3) 可追溯性与变异性：每匹马的修蹄由专业蹄铁匠单独完成，来源清晰，且不同管理实践导致了材料成分和特性的高度可变性，若加以利用可带来多样化益处；4) 物流优势：虽然全球年产量估计约10.6万吨，远少于其他角蛋白副产品，但其废弃物主要集中在大型养殖场或马厩，易于追溯和收集，有利于工业化增值；5) 结构独特性：它属于硬质颗粒状的α-角蛋白，具有独特的层级、层状结构和优异的机械性能，与羊毛的纤维状α-角蛋白或羽毛的β-角蛋白截然不同，为生物启发材料和复合材料开发开辟了独特路径。
结构与功能：自然设计的复合材料
马蹄壁是一个高度复杂的生物结构，主要由合成并沉积不同类型硬质α-角蛋白的表皮细胞构成。这些蛋白质以一种高度致密、层级分明且几何化的结构组织起来。其核心在于角蛋白纤维间广泛的分子交联（主要是二硫键），形成了一个由细长纤维嵌入周围基质中的稳定复合材料。
从分子到宏观，α-角蛋白的氨基酸形成右手α-螺旋二级结构的肽链，两个肽链缠绕形成 coiled-coil 二聚体，进而形成四聚体、原丝、原纤维，最终形成嵌入无定形角蛋白基质中的结晶中间丝（Intermediate filaments, IFs）。这些中间丝通过肽键和二硫键相互连接，组装成巨原纤维和纤维。巨原纤维被包裹在称为角质细胞的盘状细胞中，这些细胞在微观尺度上呈层状结构，最终形成包含小管和连续髓腔的层状结构。
这种密集堆积的结构提供了卓越的机械阻力、缓冲性能和能量吸收能力。然而，这种结构上的坚韧性也为其工业增值带来了直接影响：一方面，高密度的二硫键和致密的晶体性质使得提取（完全溶解）需要使用苛刻的化学处理，这促使研究聚焦于优化绿色提取方法；另一方面，其作为刚性、细颗粒废物的固有形态，使其可能独特地适合作为复合材料中的高模量增强剂。
化学成分：蛋白质与矿物质的交响乐
马蹄的化学成分以角蛋白为主，其余成分可视为微量。蛋白质含量极高，且在不同马种间无显著差异。主要氨基酸包括谷氨酸、精氨酸和丝氨酸，它们占总氨基酸的31.2-33.8%，其次是亮氨酸、天冬氨酸、脯氨酸、甘氨酸和缬氨酸。关键的含硫氨基酸半胱氨酸含量在6.00-7.28%之间。饮食等因素会影响角蛋白的氨基酸组成，进而影响其三维结构、性质与功能。
矿物质组成则因品种、环境、饮食等因素而异，并在蹄部的角化过程中扮演关键角色。钙（Ca）作为角化过程中的酶辅因子，调节细胞分化和表皮角质细胞的脱落，并影响角蛋白的硬度。铜（Cu）参与二硫键的形成，增强角蛋白基质的结构。锌（Zn）在角蛋白合成和蹄部形成中起关键作用，增强抗应激能力。主要的矿物质包括铁（Fe）、硫（S）、钾（K）和钙（Ca），其次是钠（Na）、镁（Mg）、锰（Mn）、磷（P）、铝（Al）和锌（Zn），以及少量的铜、镍、锶、铅、硒和锂。矿物质缺乏会导致蹄部结构变化，因此其组成也可作为蹄部健康与完整性的指标。
关键性质：水与力学性能的舞蹈
蹄壁的特性深受水合程度的影响，无论是过低还是过高的湿度都会对蹄壁的抗拉强度产生不利影响。活体蹄壁存在两种水合梯度：水平梯度（外表面比内部干燥）和垂直梯度（从真皮区域向地面水合度降低）。蹄壁的分子结构中，氢键在稳定角蛋白分子的α-螺旋结构以及部分交联相邻聚合物链方面起着至关重要的作用。
研究表明，蹄壁的最大吸水能力约为40%。即使在极端干燥条件下，也无法完全去除水分，表明聚合物基质内存在紧密结合的水分子。这些紧密结合的水影响着角蛋白的机械性能。水合水平显著影响其力学行为：材料在较高水合水平下表现得像弹性体，脱水时则变为坚硬的玻璃态聚合物。
在拉伸性能方面，蹄壁的杨氏模量介于410 MPa到14.6 GPa之间，具体取决于水合水平。拉伸强度在14到22 MPa之间。在压缩性能上，最佳水合条件下，蹄壁的韧性约为骨骼的一阶量级，是木材的两倍。水合相关的差异可导致抗压强度降低2到4倍。松弛测试表明，在小应变下呈线性松弛，而在较大应变下，水合水平影响松弛行为。最佳水合度（约20%含水量）能提供最佳的松弛性能。
角蛋白的提取：从坚硬结构到可用材料
从坚硬动物组织中提取角蛋白的方法通常涉及旨在破坏高度交联蛋白质结构的化学或物理处理。鉴于目前缺乏专门针对马蹄修剪废弃物的角蛋白提取数据，我们可以参考结构最接近的牛蹄和牛角的研究。
提取方法主要包括化学法（酸/碱水解、氧化、还原、离子液体）和生物法。酸和碱水解在高温下破坏硫酸基和羧基，溶解角蛋白并将半胱氨酸转化为磺基丙氨酸。氧化法使用氧化剂破坏角蛋白中的二硫键，将其转化为可溶于水的角蛋白酸。还原法使用还原剂断裂二硫键，形成游离巯基，通常需要尿素等蛋白质变性剂来增强还原剂对二硫键的可及性，并需要表面活性剂来防止重新氧化。离子液体凭借其高极性破坏角蛋白中的氢键，辅以尿素或SDS等共溶剂帮助断裂二硫键，可提高提取率。生物法则依赖于微生物或酶（特别是角蛋白酶）来分解角蛋白的刚性结构，通常需要预处理来提高效率。
从牛蹄/角的提取实践来看，使用角蛋白酶并结合高压灭菌预处理，可获得含高达60%可溶性氮的提取物。使用2-巯基乙醇等还原剂提取率较低（44%甚至3%）。而使用氢氧化钠和尿素作为变性剂的方法报道了最高的提取率（85%）和纯度（超过85%）。提取后，通常通过降低pH至角蛋白等电点以下进行沉淀，再经过滤、离心或透析，最后冷冻干燥获得纯角蛋白粉末。
应用前景：从废弃物到高价值产品
来源于蹄部的角蛋白应用研究目前较少，但已显示出在再生医学等生物医学领域作为生物材料，以及作为叶面肥（提供蛋白质、肽和游离氨基酸）的潜力。然而，马蹄壁卓越的抗冲击和能量吸收特性已成为材料开发的生物灵感来源。例如，受马蹄层状结构启发的3D打印聚乳酸材料，能通过引导裂纹沿层间扩展来增强抗断裂扩展能力。模仿牛蹄管状结构设计的3D打印材料也显示出改善的机械性能。受马蹄壁管状结构启发的设计，在抗冲击保护和能量吸收方面优于传统材料。
除了提取角蛋白，马蹄废弃物粉末的直接应用也值得探索。作为一种硬质颗粒状α-角蛋白源，与柔软的纤维状角蛋白源（羊毛、羽毛）相比，它在用作填料时可能具有优势。其固有的高模量和源自天然细胞结构的几何形状，使其可能成为热塑性基质中有效的结构增强剂。马蹄修剪物来源的角蛋白具有无虐待、高度可追溯、质量一致的特点，这对于敏感的 biomedical application 至关重要，可最大限度地降低屠宰场副产品常带来的污染风险。此外，角蛋白富含反应性官能团（特别是巯基），使得适当制备的蹄角蛋白粉末有潜力成为一种高效、低成本的生物吸附剂，用于选择性去除废水中的重金属离子和有机污染物。
升级回收与可持续性评估：迈向循环未来
据初步估算，考虑到年产量、平均含水量和与牛蹄提取率相当的提取率，马蹄修剪废弃物每年有望产出3.3至3.6万吨角蛋白，这对满足未来对蛋白质、生物聚合物和生物塑料不断增长的需求具有重要意义。
评估这些提取过程的可持续性至关重要。采用绿色提取树（Green Extraction Tree, GET）方法对牛蹄角蛋白提取工艺的评估显示，不同方法在“绿色度”上差异显著。使用角蛋白酶的生物提取法（B）和使用氢氧化钠/尿素的化学法（C）在多个绿色准则上表现相对较好，尤其是在溶剂安全性方面。而大量使用石化溶剂和还原剂的方法（A）则绿色度得分较低。这提示未来针对马蹄角蛋白的提取工艺开发，应优先考虑生物法或更温和的化学法，并致力于溶剂的循环利用和能耗的降低，以真正实现从废弃物到高价值产品的绿色、循环转化。
总之，马蹄修剪废弃物作为一个尚未被充分认识的优质角蛋白来源，在可持续材料开发、循环经济和绿色化学领域具有巨大潜力。通过深入理解其结构、成分与特性，并开发高效、环保的提取与增值策略，我们有望将这一“废弃物”转化为推动生物基产业创新的宝贵资源。
