《Nature Neuroscience》：Rapid temporal processing in the olfactory bulb underlies concentration-invariant odor identification and signal decorrelation
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在动态感官环境中，嗅觉系统如何从浓度依赖的受体活动中提取稳定的气味身份信息是核心难题。本研究通过全光学方法解析了小鼠嗅觉球中嗅小球与僧帽/丛状细胞的功能连接，发现早期响应的嗅小球及其下游细胞能够跨浓度稳健地表征气味身份，而后期响应的细胞则具有浓度依赖性。研究进一步揭示了嗅觉球网络在吸入初期存在短暂的兴奋时间窗口，随后是持久的抑制。该工作表明，清醒动物的嗅觉球通过快速时间滤波机制，在稳定气味身份表征的同时，实现了对相似气味响应的去相关，为解决气味识别的速度和鲁棒性问题提供了新见解。
在纷繁复杂的气味世界中，动物们能够迅速而准确地识别出特定的气味，比如食物、天敌或是潜在的配偶，这种能力对生存至关重要。然而，这并非易事。气味分子在空气中的浓度可以千差万别，一阵微风就可能将原本浓郁的气味稀释得极其微弱。问题的关键在于，嗅觉系统的最初传感器——嗅觉感觉神经元（OSN）的激活是强烈依赖于气味浓度的。那么，大脑是如何从这种波动不定的输入中，提取出稳定、可靠的气味“身份”信息，从而实现无论浓淡都能认出同一种气味的呢？此外，自然界中许多气味在化学结构上非常相似，它们会激活大量重叠的嗅觉受体，导致大脑接收到的初始信号模式也高度相似。嗅觉系统又如何在极短的时间内（行为实验表明可在100毫秒内完成）将这些“长相”相似的气味模式有效地区分开来，避免混淆？这两个核心问题——浓度不变性的身份识别与快速模式分离（去相关）——的神经机制，长期以来困扰着神经科学家。尽管有研究提出，嗅觉信息处理的早期阶段，即在嗅觉信息离开鼻子后首先抵达的“中转站”——嗅觉球（OB）中，可能发生了侧抑制、标准化等计算，但缺乏直接证据表明这些计算在气味识别中扮演了关键角色，并且它们通常被认为需要相对较长的时间（数百毫秒到秒），这与行为上观察到的快速识别速度存在矛盾。为了揭开嗅觉球如何处理气味信息的奥秘，理解其计算逻辑和潜在的神经机制，研究人员将目光投向了嗅觉球内部的关键转换：从接收嗅觉感觉神经元输入的嗅小球（glomeruli），到将信息传递给高级脑区的输出神经元——僧帽细胞和丛状细胞（Mitral and Tufted Cells, MTCs）。探究这一转换过程，需要能够在清醒动物中同时追踪大量嗅小球和MTCs对多种气味刺激的时空动态，建立它们之间的功能连接，并以高时间精度扰动神经活动。为此，来自国外的研究团队在《Nature Neuroscience》上发表了一项研究，他们发展了一种创新的“全光学”研究策略，为我们深入理解嗅觉球如何像一个精密的“时间过滤器”一样工作，从而同时解决浓度不变性和快速去相关这两大难题，提供了令人信服的答案。
为开展此项研究，作者主要运用了以下关键技术方法：研究使用了转基因小鼠模型（如OMP-ChR2-EYFP与Thy1-GCaMP6f杂交鼠），在嗅觉感觉神经元中表达光敏感蛋白Channelrhodopsin-2（ChR2），在MTCs中表达快速钙指示剂GCaMP6f。搭建了结合数字微镜器件（DMD）进行单光子（1P）模式化光刺激与双光子（2P）钙成像的全光学系统，可同时刺激嗅小球层并成像记录MTCs层的活动。该系统具有大视野（约2×2 mm2），能覆盖大部分背侧嗅觉球，以60Hz记录突触后嗅小球活动，以30Hz记录大量MTCs（>100个）的活动。通过将光刺激平面设置在成像平面上方约150微米，实现了在刺激单个嗅小球的同时，对其下游约150微米深的MTCs进行成像。此外，研究还采用了呼吸同步的精准气味递送系统，可呈现跨越大浓度范围（8000倍）的多种气味刺激。
结果
实验装置结合2P显微镜与1P DMD模式刺激系统
研究人员开发了一套全光学实验方法。他们将刺激平面聚焦在2P成像平面上方约150微米，允许同时刺激嗅小球层和2P成像MTCs层。通过在OMP-ChR2-EYFP与Thy1-GCaMP6f杂交鼠中进行实验，他们能够用2P钙成像记录嗅小球和MTCs的活动，同时用DMD系统对表达ChR2的嗅觉感觉神经元轴突末梢所在的特定嗅小球进行精准的光遗传学刺激。这使他们能够识别出对特定嗅小球光刺激有响应的MTCs，即与该嗅小球功能连接的“子代MTCs”。
子代与非子代MTCs的反应特性
一个关键问题是，MTCs的输出在多大程度上由其“亲代”嗅小球（小球内信号）的直接输入塑造，又在多大程度上受到嗅觉球内其他嗅小球（小球间信号）的横向信号影响。通过记录MTCs对多种气味在两个浓度下的反应，他们发现，连接到不同嗅小球的子代MTCs在气味呈现期间的活动模式是多样化的，而接收来自同一嗅小球输入的子代MTCs则表现出高度一致性。量化分析表明，小球间处理在子代MTCs反应中施加了高 stereotypy（刻板模式），使得姐妹细胞之间的成对相关性非常高（中位数 r=0.88）。同时，来自不同嗅小球的MTCs之间的相关性要低得多（中位数 r=0.13），有效地在这一水平上对气味表征进行了去相关。
早期响应的嗅小球和MTCs在不同浓度间保持不变
为了寻找神经活动中浓度不变的特征，研究人员记录了嗅小球和MTCs对相同八种气味在两到三种浓度下的反应。对于嗅小球，他们根据激活潜伏期对嗅小球进行排序，发现尽管有反应的嗅小球集合在不同浓度间发生了很大变化，但对所有浓度都有反应的子集在很大程度上保持了它们在潜伏期排序中的位置。对于MTCs，他们发现增加气味浓度会改变有反应的细胞集合，但最早的反应在不同浓度间 largely preserved。他们将有反应的MTCs分为两组：一致的（对高、低浓度均有兴奋反应）和不一致的（仅对一种浓度有兴奋反应）。一致的MTCs反应的潜伏期强烈偏向于吸气周期之初，而不一致的反应通常具有更长的潜伏期。这些发现提供了强有力的证据，表明早期嗅小球和MTCs反应都携带着关于气味身份的浓度不变信息。
气味反应从嗅小球到MTCs的转换
正如结果所示，一种气味以独特的时间顺序激活一组嗅小球，这可能是由于其相应受体的结合亲和力不同所致，高亲和力受体在吸气后更早激活，低亲和力受体激活较晚。这些嗅小球为其子代MTCs提供直接兴奋性输入，但尚不清楚嗅小球激活的时机是否影响其子代MTCs的反应性质。为了探究这一问题，他们识别了一部分嗅小球的子代MTCs，并分析了MTCs气味反应与亲代嗅小球反应特性之间的关系。他们发现，连接到早期激活的亲代嗅小球的子代MTCs表现出强烈的兴奋反应，而连接到后期激活的嗅小球的子代MTCs在气味递送的早期阶段大多表现出抑制反应，即使其亲代嗅小球对气味表现出强烈的兴奋反应。在所有条件下，他们发现连接到排序靠前（即早期激活）的亲代嗅小球的子代MTCs表现出兴奋反应，而表现出抑制反应的子代MTCs则连接到排序分布广泛的亲代嗅小球。在反应潜伏期分布上也观察到类似的情况：具有兴奋反应的子代MTCs连接到的亲代嗅小球，几乎全都在第一个被激活的嗅小球之后20毫秒内被激活。研究人员还观察到，平均而言，嗅小球反应幅度随反应潜伏期增加而减小。因此，连接到反应幅度最高的亲代嗅小球的子代MTCs主要表现出兴奋反应。这些发现支持了单个嗅小球反应的幅度和潜伏期是紧密耦合的。
不同嗅小球单元之间的时间相互作用塑造气味表征
基于在已定义的嗅小球单元（亲代嗅小球及其连接的子代MTCs）中的气味反应，研究人员假设，初始的兴奋性驱动之后会募集一个抑制性网络，从而创造一个时间窗口，在此期间MTCs主要从其亲代嗅小球接收兴奋。为了测试亲代嗅小球激活时机如何影响子代MTCs反应的幅度，他们使用简短的光遗传学刺激，在相对于吸气开始的不同脉冲潜伏期，探测了子代MTCs的兴奋性。他们既在单独条件下，也在能引发广泛嗅小球活动模式的气味存在下，递送这些脉冲。他们预期，在背景气味存在的情况下，只有早期脉冲能有效激活子代MTCs，而后期脉冲会被早期被气味激活的嗅小球所募集的抑制网络所抑制。使用这种光遗传学方法使他们能够锁定目标嗅小球的激活幅度，从而选择性地研究时机在子代MTCs兴奋性中的作用。
为此，他们使用了一种转基因小鼠品系，其中M72受体和ChR2基因被插入到S50受体基因座。他们将此品系与Thy1-GCaMP6f小鼠品系杂交，以成像记录突触后嗅小球和MTCs活动。然后，他们比较了M72嗅小球对其强配体（2-羟基苯乙酮）和弱配体（苯甲醛）的反应。正如预期，2-羟基苯乙酮在低浓度和高浓度下都能在M72亲代嗅小球及其连接的子代MTCs中引发强烈的兴奋反应。相比之下，弱配体（如苯甲醛）的低浓度并未激活M72嗅小球，反而募集了背侧嗅觉球的其他嗅小球。当他们不提供气味仅呈现光遗传学脉冲时，子代MTCs的反应幅度几乎与脉冲潜伏期无关。将脉冲呈现与2-羟基苯乙酮配对，增加了子代MTCs的反应幅度，然而增幅较小，可能是由于反应饱和。在低浓度和高浓度苯甲醛存在的情况下，子代MTCs对M72亲代嗅小球光刺激的反应性在短暂的间隔（约30毫秒）后急剧下降。这可以解释为来自苯甲醛激活的其他嗅小球对M72子代MTCs的抑制。这种抑制持续了超过180毫秒，这与体外研究中测量的侧抑制时间过程一致。在OMP-ChR2-EYFP × Thy1-GCaMP6f小鼠品系中进行的实验也验证了这一现象的普遍性。他们识别了特定嗅小球的子代MTCs，并使用一系列不同浓度的气味进行了嗅小球层成像。他们识别了五个嗅小球-配体对，使得所选配体仅在高浓度下激活该嗅小球，并且能在视场中找到该特定嗅小球子代MTCs。与在M72嗅小球中观察到的类似，在气味存在下，其子代MTCs对光刺激的反应性在吸气开始后60毫秒或更晚呈现的脉冲急剧下降。这些发现强有力地支持了存在一个时间依赖的过滤器，推测是由嗅小球-嗅小球抑制性相互作用介导的，作为嗅觉球网络中的一个普遍计算原则。在这个方案中，早期激活的嗅小球的兴奋性驱动先于抑制性驱动，从而创造了一个短暂的时间窗口，在此期间MTCs可以以最小的干扰传递其亲代嗅小球的输入。
M72嗅小球气味反应传递在强弱配体存在下的情况
在建立了兴奋性时间窗口并使用光遗传学方法进行表征后，他们随后使用气味刺激测试了这一现象。他们观察到，低浓度2-羟基苯乙酮的
