经过形态工程设计的镍-亚氨基二乙酸功能化琼脂糖磁性微球，用于提高多组氨酸标记蛋白的纯化效果

《Carbohydrate Polymers》：Morphology-engineered nickel-iminodiacetic acid functionalized agarose magnetic microspheres for enhanced polyhistidine-tagged protein purification

镍-IDA功能化琼脂糖磁性微球（MAMs/Ni-IDA）通过乳液-固结策略制备，优化8%磁性纳米粒子负载率实现结构稳定与高环氧基密度（72.4 μmol/g），结合Ni2?-IDA配位作用高效捕获His标记蛋白（28.3 kDa），经六次循环纯化后吸附能力保留超95%，磁响应性优异（16 emu/g）。

　　

秦音|罗婷芳|翁慧芬|张永辉|庄晓燕|肖安峰|肖琼

厦门集美大学海洋食品与生物工程学院，中国福建省361021

摘要

通过乳液固化策略，合理设计并合成了形态工程化的镍亚氨基二乙酸（Ni-IDA）功能化琼脂糖磁性复合微球（MAMs/Ni-IDA），用于高效选择性纯化带组氨酸（His）标签的蛋白质。这些复合微球是通过将大尺寸的Fe₃O₄磁性纳米颗粒（MNPs）嵌入琼脂糖基质中，并进行Ni²⁺螯合IDA功能化制备的。当MNPs负载量为8%时，微球表现出最佳性能，这有效抑制了微球聚集并最大化了环氧基团密度（72.4 μmol/g），为后续IDA的固定奠定了坚实基础。包括光学显微镜、激光粒径测量、振动样品磁强计（VSM）、傅里叶变换红外光谱（FT-IR）和元素分析（EDS）在内的综合表征证实，MAMs/Ni-IDA微球具有成功的结构形成、明确的形态和优异的磁响应性。Irregular@MAMs/Ni-IDA的饱和磁化强度为16 emu/g，确保了快速高效的磁分离。Zeta电位的变化验证了IDA/Ni²⁺的接枝效果。重要的是，Irregular@MAMs/Ni-IDA对目标His标签蛋白质（28.3 kDa）保持了出色的选择性和可回收性，在连续六次纯化循环后仍保留了超过95%的初始吸附能力，优于商业产品。这些发现共同凸显了形态工程化的Irregular@MAMs/Ni-IDA作为学术研究和工业生物加工中高效且经济实惠的His标签蛋白质纯化吸附剂的巨大潜力。

引言

蛋白质几乎是所有生命过程中基本构建块之一。蛋白质纯化技术的进步对于理解其结构特征、物理化学性质和生物学原理以及指导工业应用具有重要的理论和实践价值（Atsavapranee等人，2021年）。已经开发出多种蛋白质纯化方法来分离高质量蛋白质。亲和层析因其高效和高选择性的分离能力而成为最广泛使用的纯化技术。该技术依赖于将高度特异性的生物或合成亲和配体固定在固相基质（如琼脂糖凝胶、磁珠）上，从而通过特异性结合相互作用捕获目标分子（Qi和Chen，2024年）。在亲和层析中，固定化的金属亲和层析（IMAC）被广泛用于蛋白质的选择性纯化。IMAC主要涉及将金属螯合剂（如亚氨基二乙酸、硝基三乙酸）共价结合到固相基质表面，然后与固定的金属离子（Ni²⁺、Cu²⁺、Zn²⁺）配位，形成稳定的复合物，这些复合物能够通过定向配位作用特异性识别并结合目标蛋白质的组氨酸残基（Hao等人，2021年）。融合标签已成为纯化不可或缺的工具，其中连续组氨酸标签（His-tag）由于其小尺寸、低免疫原性和在各种纯化平台上的广泛应用而成为最常用的标签。His-tag可以通过金属螯合剂（如亚氨基二乙酸IDA、硝基三乙酸NTA和三（羧甲基）乙二胺TED）与固定的过渡金属离子（Ni²⁺、Cu²⁺、Zn²⁺、Co²⁺）配位，因为它们具有强兼容性、适合大规模生产并能获得高纯度产物。Ni-IDA、Ni-NTA和Ni-TED亲和层析在螯合配体上存在根本差异，这决定了它们的镍配位和蛋白质结合特性。IDA是三齿配体，使Ni²⁺有三个暴露的配位位点；NTA是四齿配体，有两个暴露位点；TED是五齿配体，只有一个暴露位点。这导致了一个关键的权衡：IDA由于有三个可用位点，为His标签蛋白质提供了最高的理论结合能力和最快的结合动力学，但与更稳定的NTA和TED相比，Ni²⁺的稳定性较低。因此，Ni-IDA微球特别适用于需要从有限样本中获得最大产量的应用、高通量工作流程中的快速捕获以及成本效益，尽管在时间敏感的应用中需要小心处理以防止Ni²⁺的泄漏（Remans等人，2022年）。

层析介质载体包括多种材料，如琼脂糖、聚苯乙烯、纤维素、葡聚糖、二氧化硅和合成聚合物。虽然聚苯乙烯为HPLC应用提供了机械刚性，但其疏水性可能导致生物分子变性。相反，琼脂糖因其大孔结构、高亲水性和最小的非特异性吸附而成为生物分离的黄金标准，能够保持生物分子的完整性并实现大生物分子的高结合能力。其易于修饰的羟基基团便于多种配体的固定（例如用于IMAC的Ni-IDA）（Gu等人，2017年；Mofidian等人，2020年）。基于琼脂糖的磁性微球代表了分离技术的创新进展，将琼脂糖的固有生物相容性和大孔结构与磁响应性结合在一起（G?dke等人，2017年）。基于Fe₃O₄的磁性微球已被广泛开发为高性能载体，用于构建各种亲和和印迹材料，因为它们具有优异的超顺磁性、良好的生物相容性和灵活的表面功能化特性（Liu等人，2024年）。这种混合结构相比传统层析介质具有显著优势，特别是实现了无需离心的高速分离，便于在微孔板格式中进行高通量处理，大大降低了剪切应力，保护了易损生物分子的完整性，并且适用于即时诊断和机器人平台。然而，仍存在体积结合能力较低、生产成本较高、工业应用的可扩展性受限以及在恶劣条件下的磁稳定性问题。尽管存在这些挑战，它们对于高通量筛选平台、即时诊断系统和温和的磁激活细胞分选具有内在的适用性，使其成为变革性工具。要实现更广泛的采用，需要专注于材料工程方面的改进，以增强结合能力、提高磁稳定性并降低制造成本，从而解决当前的性能-经济性权衡问题。

假设具有最快结合动力学的Ni-IDA琼脂糖磁性微球（MNPs@MAMs/Ni-IDA）是His标签蛋白质纯化的最佳研究模型。通过优化磁性核心的制备方法，获得了低成本和高稳定性的磁性核心，从而解决了高成本和磁稳定性差的问题。同时，通过优化磁性核心的用量、环氧基团密度和在制备磁性微球过程中的负载能力，减轻了低负载能力的问题。在此基础上，综合使用了SEM、EDS、VSM、FT-IR和实时蛋白质纯化等技术来评估MNPs@MAMs/Ni-IDA的应用性能。结果表明，所得到的MNPs@MAMs/Ni-IDA在组氨酸标签蛋白质纯化领域显示出有希望的应用前景。

材料

琼脂糖（重量平均分子量Mw = 335,000 Da，凝胶化温度35–37°C，熔化温度87–89°C，凝胶强度≥1200 g/cm²，电渗压≤0.15，硫酸盐含量≤0.15%，水分含量≤10%）购自中国福建省厦门市志春生物技术有限公司。Span 80和液体石蜡购自中国汕头市西龙科技有限公司，环氧氯丙烷（EPI）和乙二醇二缩水甘油醚（EGDE）购自Maclin生化公司

MNPs的制备机制、SEM、VSM、磁分离时间、FT-IR和XRD

在溶热合成磁铁矿（Fe₃O₄）纳米颗粒的过程中，一个关键挑战在于如何在保持高产量的同时实现工业可扩展性。传统的体积缩放策略往往会导致热传递和质量传递不足、反应不均匀性和安全风险。为了解决这些问题，本研究采用了浓度强化方法，增加了铁前体（FeCl₃·6H₂O）的用量，同时保持溶剂（乙二醇EG）体积不变

结论

总之，我们开发了一种简便的MAMs/Ni-IDA制备方法，用于从复杂生物样本中选择性和高效地分离His蛋白。这种高性能的磁性琼脂糖复合材料是通过乳液-固化方法制备的，乳液中含有琼脂糖、MNPs以及作为识别配体的Ni-IDA。使用高速剪切机进行乳化以控制磁性琼脂糖微球的粒径，并进一步提高其比表面积

CRediT作者贡献声明

秦音：撰写——审阅与编辑、方法学、资金获取、概念构思。罗婷芳：撰写——审阅与编辑、初稿撰写、方法学、正式分析。翁慧芬：初稿撰写、实验研究、正式分析。张永辉：实验研究、正式分析。庄晓燕：项目管理。肖安峰：验证、软件操作。肖琼：监督、资金获取。

未引用参考文献

Hernandez-Leon等人，2019

利益冲突声明

作者与本研究无利益冲突。

致谢

本工作得到了国家自然科学基金（项目编号：32201941；22278173）、福建省自然科学基金（项目编号：2025 J01338）、博士培养研究资助（项目编号：BSPK016）、交叉研究项目（项目编号：2023xhx233）、厦门市自然科学基金（项目编号：3502Z20227054）以及集美大学科学研究基金（项目编号：ZQ2021046）的支持。