通过酶氧化法制备的ε-聚-L-赖氨酸接枝纳米纤维素，用于制备高内相Pickering乳液和营养保健品递送系统

《Carbohydrate Polymers》：ε-poly-l-lysine–grafted nanocellulose prepared by enzymatic oxidation for high-internal-phase Pickering emulsions and nutraceutical delivery

本研究通过TEMPO/laccase/O?氧化结合醛基导向希夫碱偶联制备ε-聚赖氨酸接枝纳米纤维素（ε-PL-TLOCN），其具有高比表面积和两性表面特性，可在低于0.8wt%的纳米纤维素浓度下稳定高内相乳液（HIPEs），并显著提高曲美林的光稳定性和肠道生物可及性至60%。该绿色工艺有效保持了纤维素纳米纤丝的天然结构，为多功能纳米纤维素和食品级乳液递送系统提供了新策略。

　　

黄静怡 陈|邹玉军|唐崇|林青阳|吴杰|奥兰多·J·罗哈斯|范一民

江苏省高效利用森林资源协同创新中心，国际森林化学品与材料创新中心，南京林业大学，龙盘路159号，南京，210037，中国

摘要

本研究提出了一种制备ε-聚-L-赖氨酸接枝纳米纤维素的方法，该方法通过TEMPO–漆酶/O?氧化后进行醛导向的席夫碱偶联反应实现。所得纳米纤维的长度为0.8–1.2 μm，表现出两性行为，ζ电位范围在+49至?28 mV之间；在pH 9条件下进行席夫碱接枝时，表面氨基团密度达到最高值，为0.915 ± 0.08 mmol g?1。由于具有高长径比的纤维形态和两性表面功能，ε-PL–TLOCN能够形成超稳定的油水高内相乳液（HIPEs），其油体积分数可达82%，且所需纳米纤维浓度低于0.8 wt%（而传统的胺化纳米纤维素体系则需要更高的颗粒负载量）。以姜黄素作为模型亲脂性营养保健品，实验结果表明，这种HIPEs的光稳定性得到提升，其体外胃肠道生物利用度增加了约60%（相比之下，纯油体的生物利用度约为30%）。这些结果表明，酶氧化结合席夫碱接枝是一种构建多功能纳米纤维素的有效途径，并突显了ε-PL–TLOCN作为高内相乳液和口服递送系统稳定剂的潜力。

引言

纤维素是一种由β-1,4-连接的葡萄糖单元组成的线性多糖，是自然界中最丰富的可再生生物聚合物之一。由于其生物相容性、生物降解性、结构多样性和机械强度，纤维素在食品、生物医学和胶体应用中得到了广泛应用。当纤维素被加工成纳米级构建块（如纤维素纳米纤维CNFs和纤维素纳米晶体CNCs）时，它还具备额外的优势，包括高比表面积、丰富的表面羟基团以及可调的界面性能，这使得纳米纤维素特别适合用于乳液稳定和递送系统（Galkina等，2015；L?bmann & Svagan，2017；Pandey，2021；Qasim等，2021）。

在这些应用中，基于纳米纤维素的皮克林乳液作为传统表面活性剂稳定乳液的替代品受到了越来越多的关注（Dai等，2020；Li等，2021）。在这种体系中，固体颗粒不可逆地吸附在油水界面，形成空间和机械屏障，防止液滴聚集。与分子乳化剂相比，纳米纤维素具有多种优势，如可再生来源、低毒性以及能够形成相互连接的纤维网络。特别是CNFs的高长径比不仅有助于界面吸附，还有助于形成连续相网络，这两点都有助于提高乳液稳定性。这些特性使得纳米纤维素在制备高内相乳液（HIPEs）方面具有特别大的潜力，这类乳液的油体积分数通常达到0.74或更高。HIPEs在食品、制药和营养保健品配方中备受关注，因为它们对亲脂性活性成分的负载能力很强（Fujisawa等，2017；Salas等，2014；Szlapak Franco等，2020；Xiao等，2018）。然而，HIPEs中油滴的紧密堆积对稳定剂提出了严格要求，稳定剂必须提供有效的界面覆盖和结构支撑，同时保持低颗粒负载量、可接受的粘度和配方兼容性。

尽管如此，由于天然纳米纤维素本身具有较高的亲水性和不足的界面活性，其在实际应用中作为皮克林稳定剂的用途仍然受到限制（Huang等，2020）。未经改性的CNFs和CNCs往往主要留在水相中，通常需要较高的浓度才能稳定乳液，尤其是HIPEs（Costa等，2020）。这一限制在可食用或健康相关配方中更为明显，因为过高的颗粒负载可能会影响加工性、口感、成本效益和配方简易性（Bago Rodriguez & Binks，2022；Cai等，2025）。因此，表面功能化已成为调整纳米纤维素两性性和界面亲和力的重要策略。最新研究表明，疏水性烷基接枝可以增强CNFs在油水界面的吸附能力并提高乳液稳定性，同时指出乳液行为取决于纤维长径比、表面化学性质和油组成的协同作用（Tanzawa等，2024）。类似地，改性的细菌纤维素纳米纤维已被证明能够形成粘弹性界面膜和纤维网络，从而增强乳液稳定性并调节界面传输（Seo等，2021）。这些进展表明，有效的皮克林稳定不仅需要合适的表面功能，还需要保持纳米纤维的形态和网络形成能力（Cheng等，2025；Liu等，2018；Ma等，2022；Yang等，2025）。

为了调整纳米纤维素的表面性质，人们探索了多种化学改性方法，包括酯化、醚化、氧化、硅烷化和聚合物接枝（H. Chen等，2022；H. Chen等，2022；Darpentigny等，2020；Hou等，2025；Isogai等，2018；Leite等，2017；Vanderfleet & Cranston，2020）。其中，胺化方法特别有吸引力，因为引入氨基不仅可以改变润湿性和界面行为，还可以扩展化学反应性，并赋予额外的功能，如抗菌活性、电响应性和与生物活性分子的相互作用（Chen等，2018；Song等，2026；Yin等，2024）。在皮克林乳液体系中，氨基功能化的纳米纤维素可以提供更好的界面亲和力、增强的胶体稳定性，并有可能构建多功能递送平台（Zhang等，2023；Zhang等，2023）。然而，许多报道的胺化方法依赖于强氧化剂、多步骤合成路线或不适合清洁标签或可食用应用的偶联化学。例如，过氧酸盐氧化会产生二醛纤维素，但往往会破坏纤维素的天然结构；而碳二亚胺介导的与羧基化纤维素的偶联通常需要额外的试剂和复杂的纯化步骤（Chen等，2018；Darpentigny等，2020；Kaldéus等，2018；Tarchoun等，2021）。因此，仍需要更环保且能保持纤维素结构的方法来引入氨基功能。

在这种情况下，ε-聚-L-赖氨酸（ε-PL）是一种有吸引力的接枝成分。ε-PL是一种天然发酵的、食品级的、公认安全的（GRAS）阳离子多肽，含有丰富的伯氨基和内在的抗菌活性（Rodrigues等，2020）。因此，将ε-PL接枝到氧化纤维素上有望同时增加氨基密度、改善界面功能并引入生物活性。然而，要充分利用ε-PL接枝效果，需要一种既能生成反应位点又能最小化对纤维素天然纤维和晶体结构损害的氧化方法。

最新研究表明，TEMPO/漆酶/O?介导的氧化是一种温和且环境友好的纤维素氧化方法（H. Chen等，2022；Jiang等，2020；Jiang等，2021）。与传统的强氧化方法不同，TEMPO/漆酶/O?体系可以在水相和相对温和的条件下引入醛基和少量的羧基。这些醛基为后续的席夫碱偶联提供了反应位点，同时保持纤维素纳米纤维的结构，有望保留高效皮克林稳定所需的高长径比和网络形成能力。因此，酶氧化后接枝富氨基生物聚合物是一种构建具有定制界面性质的多功能纳米纤维素的有前景的方法。

与稳定剂设计并行，选择递送的活性化合物对于评估乳液系统的实际应用性也很重要。姜黄素是一种天然的亲脂性营养保健品，具有广泛的抗氧化、抗炎和促进健康的活性。然而，由于其水溶性差、口服生物利用度低以及对光和环境降解的敏感性强，其实际应用受到限制。将其封装在结构化的油水乳液中（尤其是HIPEs中）可以为姜黄素的保护和胃肠道递送提供有效的途径。因此，一种结合了结构稳定性、界面保护和功能表面化学的纳米纤维素稳定化的HIPE可以为姜黄素的递送提供有价值的平台。

在这项研究中，我们开发了一种绿色且简便的方法，通过酶氧化后进行醛导向的席夫碱偶联，制备了ε-聚-L-赖氨酸接枝的TEMPO/漆酶/O?氧化纤维素纳米纤维（ε-PL-TLOCN）。氧化步骤引入了醛基和少量的羧基，同时保持了纤维素的结构；随后的ε-PL接枝产生了具有两性特性的富氨基纳米纤维。我们假设，保持高长径比的纳米纤维和定制的表面功能相结合，将促进高效的界面吸附和连续相结构的形成，从而能够在相对较低的纳米纤维负载量下稳定油水HIPEs。以姜黄素作为模型亲脂性营养保健品，我们进一步评估了所得HIPEs的光稳定性和体外胃肠道生物利用度。这项工作为基于多功能纳米纤维素的皮克林稳定剂提供了可持续的制备途径，并扩展了酶修饰多糖在先进食品胶体和营养保健品递送系统中的应用潜力。

材料

硬木漂白牛皮纸浆（HBKP）购自Asia Symbol（山东）纸浆造纸有限公司。关于起始HBKP的基本特性（包括聚合度（DP）和化学组成）详见表S1；确定DP和化学组成的详细分析程序见支持信息。使用前用蒸馏水彻底清洗。漆酶（来自Trametes versicolor）、TEMPO和2,2′-偶氮双...

ε-PL–TLOC的制备与表征

如图1所示，纤维素纤维通过TEMPO/漆酶/O?体系进行氧化，生成TEMPO/漆酶/O?氧化纤维素（TLOC）。这种氧化途径预期会在纤维素表面引入醛基（–CHO）和羧基（–COO?）。与传统的TEMPO氧化纤维素不同，TLOC中的醛基为后续的席夫碱偶联提供了合适的反应位点。

结论

我们开发了一种可持续且温和的方法，通过醛导向的席夫碱偶联制备了ε-聚-L-赖氨酸接枝的TEMPO/漆酶/O?氧化纳米纤维素（ε-PL–TLOCN）。该方法保留了纤维素的天然I晶态结构，同时引入了高密度的表面氨基，生成了具有优异分散性和广泛pH范围界面亲和力的两性纳米纤维。

CRediT作者贡献声明

黄静怡 陈：撰写 – 原稿撰写、方法学设计、数据管理、概念构思。邹玉军：可视化处理。唐崇：可视化处理。林青阳：数据管理。吴杰：撰写 – 审稿与编辑。奥兰多·J·罗哈斯：撰写 – 审稿与编辑、指导。范一民：撰写 – 审稿与编辑、指导。

利益冲突声明

作者声明没有利益冲突。

致谢

本研究得到了国家自然科学基金（编号32271812）和江苏省自然科学基金（编号BK20231294）以及江苏省研究生研究与实践创新计划（编号KYCX23_1165）的支持。H.C.和O.J.R.还感谢加拿大卓越研究主席计划（资助编号CERC-2018-00006）和加拿大创新基金会（项目编号38623）的支持。