利用糖苷酶水解法对Hypsizygus marmoreus中β-葡聚糖中的葡萄糖醛酸的结构进行解析及其分布规律的研究

《Carbohydrate Polymers》：Structural elucidation and distribution pattern of glucuronic acid in β-Glucan from Hypsizygus marmoreus using glycosidase hydrolysis

该研究从热带蘑菇H. marmoreus中分离出一种约20kDa的异葡萄糖聚合物，通过甲酰化分析和核磁共振（NMR）确定其主链为β-1,6-连接的d-葡萄糖吡喃糖残基，部分酸水解和糖苷酶解结合质谱分析揭示了葡萄糖醛酸（GlcA）以t-β-D-GlcA和β-1,4-D-GlcA形式存在于O-3位，并指出该异葡萄糖包含三种结构域对活性关系研究至关重要。

　　

作者：Yunhe Qu, Ziyan Sun, Xiushi Jia, Yuanning Wang, Xing Yang, Yunmei Ma, Kevin H. Mayo, Lin Sun, Dongfang Shi, Yifa Zhou

单位：长春师范大学创新科学与技术研究院，中央实验室，中国长春市北长吉路677号，邮编130032

摘要

从Hypsizygus marmoreus中分离出一种约20 kDa的异多糖，该多糖由葡萄糖（Glc）和葡萄糖醛酸（GlcA）组成。通过甲基化分析和核磁共振（NMR）初步研究表明，其主链由β-1,6-连接的d-葡吡喃糖基（Glcp）残基构成，O-3位置上含有t-β-D-Glcp残基的分支。通过部分酸水解和糖苷酶水解进一步确定GlcA的连接方式。HILIC-FLR/ESI-MSⁿ、甲基化分析和NMR结果显示，GlcpA以t-β-D-GlcpA和β-1,4-D-GlcpA的形式存在于主链中Glc的C-3位置。此外，这种β-葡聚糖表现出结构异质性，包含三个不同的结构域：(a)未取代的β-1,6-葡聚糖；(b)含有1–2个GlcA残基的β-1,6-异葡聚糖；(c)含有单个Glc残基的β-1,6-异葡聚糖。所提出的异多糖结构为了解蘑菇来源的β-1,6-葡聚糖的结构多样性提供了关键见解，有助于未来对其结构-活性关系的研究。

引言

Hypsizygus marmoreus（简称H. marmoreus）是一种广泛分布于亚洲的大型腐生真菌，因其营养价值高、热量低和脂肪含量低而受到重视（Lang等人，2025年）。最近对其生物活性成分的研究表明，H. marmoreus的多糖（HMPs）具有显著的生理活性，包括抑制肿瘤细胞增殖的作用（Li等人，2012年；Li、Wang、Wang、Walid和Zhang，2012年）、调节免疫系统（Zhou等人，2019年）、抗氧化作用（Huang等人，2024年；Huang、Wu和Lu，2024年）以及调节肠道微生物群（Ye等人，2023年）。 根据单糖组成，HMPs主要由葡萄糖（Glc）、半乳糖（Gal）、甘露糖（Man）、岩藻糖（Fuc）和其他单糖组成（Huang等人，2024年；Huang、Wu和Lu，2024年）。最新的结构分析发现了一种名为岩藻半乳聚糖的成分（17.1 kDa），其主链由(1→6)-连接的α-D-葡吡喃糖基残基构成，O-2位置上主要连接有β-D-Manp和α-L-Fucp残基（Oliveira等人，2019年）。此外，还分离出一种均一的β-葡聚糖（394 kDa），其分支结构中β-(1→6)-葡聚糖主链的O-3位置以1:1的比例连接着非还原性的β-Glcp或β-(1→3)-连接的β-Glcp侧链（Wang等人，2021年）。值得注意的是，除了中性六碳糖外，蘑菇多糖还含有少量的葡萄糖醛酸（GlcA）。GlcA的存在可能会影响其理化性质和生理活性。例如，在超声降解过程中，GlcA的含量与多糖的解聚行为有关（Xiao等人，2022年）。GlcA的羧基（-COOH）具有吸电子作用，会改变糖环的空间结构（Kerins等人，2018年）。因此，需要进一步研究GlcA在蘑菇多糖中的分布模式及其对理化性质和生理活性的影响。 目前用于分析多糖结构的方法包括气相色谱-质谱（GC–MS）（Cui等人，2021年）、核磁共振（NMR）（Yasuhiro & Hajime，2010年）、高效液相色谱（HPLC）、超高效液相色谱（UPLC）（Yang等人，2023年）和基质辅助激光解吸电离质谱（MALDI-TOF-MS）（Reis等人，2003年）。特别是UPLC-MS凭借其高灵敏度、高分辨率和准确性，在寡糖结构解析方面具有优势（Zhang等人，2021年）。然而，现有的多糖结构分析方法只能揭示其平均结构，侧链的类型、长度和排列方式仍不清楚，因此无法准确确定GlcA的分布情况（Grachev等人，2007年）。为克服这一局限，本研究采用部分酸水解和糖苷酶水解技术将多糖降解为寡糖片段，从而推断出母体的结构信息。在各种水解方法中，由于酶促水解具有较高的特异性和稳定性，且能获得高纯度的寡糖组分，因此被优先选择（Huang等人，2024年；Huang、Wu和Lu，2024年；Lu等人，2018年；Pandeirada等人，2022年）。 仅使用单一方法对多糖进行详细的结构表征和鉴定仍然具有很大挑战性（Lobvi等人，2004年）。因此，本研究采用了一种综合分析方法，结合传统技术和新兴的糖苷酶水解辅助仪器方法，全面阐明了从H. marmoreus中提取的异多糖中的葡萄糖醛酸的结构特征、连接方式和位置。这种方法不仅克服了传统多糖表征方法的局限性，还为解决复杂葡聚糖系统中的结构异质性问题提供了方法论范例。所揭示的架构对于理解生物活性蘑菇多糖的结构-活性关系至关重要。

材料

H. marmoreus的子实体从中国长春采集，并通过rDNA-ITS测序进行了分类鉴定。β-葡糖苷酶（E-BGOSPC）购自Megazyme International Ireland Ltd.（爱尔兰威克洛）。Westase（CAT 9005）购自TaKara（日本）。标准品包括甘露糖（Man）、葡萄糖（Glc）、半乳糖（Gal）、鼠李糖（Rha）、岩藻糖（Fuc）、木糖（Xyl）、阿拉伯糖（Ara）和葡萄糖醛酸（GalA）等。

从H. marmoreus中分离HM-1

从H. marmoreus的子实体中提取了总多糖，其产率为干重的7.1%，总糖含量为85.9%，尿苷酸含量为4.9%，蛋白质含量为1.8%。总多糖被分为中性多糖和酸性多糖，随后进一步纯化酸性多糖，得到HM-1，其产率为总多糖的23.6%（图S1）。

讨论

其他真菌中也发现了含有GlcA的多糖。例如，Yan等人从Pleurotus ostreatus的子实体中分离出一种含有9.5% GlcA的β-(1→6)-D-葡聚糖。与本研究不同，该真菌中的GlcA仅以t-β-D-GlcA的形式存在（Yan等人，2019年）。Zhang等人从Ganoderma atrum的子实体中分离出一种高度分支的酸性β-(1→3),(1→6)-D-葡聚糖，其中GlcA以β-1,4-D-GlcA的形式存在。

结论

本研究成功阐明了从H. marmoreus子实体中分离出的约20 kDa β-1,6-异葡聚糖的结构及GlcA的分布情况。通过部分酸水解和靶向糖苷酶水解（使用Westase和β-葡糖苷酶）结合先进的仪器分析（包括HILIC-FLR/ESI-MSⁿ和MALDI-TOF-MS）对GlcA的取代模式进行了表征。结构分析显示，该β-1,6-葡聚糖...

作者贡献声明

Yunhe Qu：撰写初稿。 Ziyan Sun：实验研究。 Xiushi Jia：数据分析。 Yuanning Wang：数据整理。 Xing Yang：数据分析。 Yunmei Ma：数据整理。 Kevin H. Mayo：撰写、审稿与编辑、数据整理。 Lin Sun：撰写、审稿与编辑。 Dongfang Shi：撰写、审稿与编辑。 Yifa Zhou：撰写、审稿与编辑。

利益冲突声明

作者声明没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文的研究结果。

致谢

本研究得到了吉林省科学技术厅（YDZJ202401433ZYTS）和吉林省教育厅科研项目（JJKH20261191KJ）的支持。