关于藻酸盐寡糖在Epstein-Barr病毒阳性的鼻咽癌中的抗癌活性的体外和计算机模拟研究

《Carbohydrate Research》：In vitro and in silico studies on anticancer activities of alginate oligosaccharide in Epstein-Barr virus-positive nasopharyngeal carcinoma

本研究探讨酶解获得的 alginate oligosaccharides (AOS) 对鼻咽癌细胞系 C666-1 的增殖抑制作用，发现 AOS 在浓度 >10 mg/mL 时抑制细胞生长，低浓度则促进，并通过分子对接和动态模拟提出其可能通过结合 FGFR1/FGF2 通路发挥作用。

　　

Darshini Mohan | Jian Cheng Henry Choong | Boon-Keat Khor | Vikneswaran Murugaiyah | Aik-Hong Teh | Beow Keat Yap

马来西亚科学大学药学院，11800 Gelugor，槟城，马来西亚

摘要

藻酸盐寡糖（AOS）最近在抑制骨肉瘤肿瘤生长方面显示出良好的效果。然而，目前尚不清楚AOS是否也对鼻咽癌（NPC）有效。为此，研究了酶法制备的AOS对EBV阳性的NPC细胞系C666-1的抗增殖作用。MTT细胞毒性实验显示，在浓度高于10 mg/mL时，AOS对C666-1细胞系具有抗增殖效果，但在较低浓度下则会促进细胞生长。由于AOS具有类似肝素硫酸盐的双相效应，因此推测其可能通过影响成纤维细胞生长因子（FGFs）及其受体（FGFR）来发挥作用。计算机模拟分子对接实验进一步支持了这一假设，发现AOS五糖与肝素五糖在FGF2、FGFR1及FGF2-FGFR1复合物上的结合模式相似。全原子分子动力学模拟结果表明，当每个FGFR1二聚体结合一个AOS分子时，只有AOS五糖能够促使FGFR1二聚体形成，而其他AOS模型（DP2-DP4）在模拟过程中会改变FGFR1二聚体的结构，从而不利于FGF2的结合；相反，当每个FGFR1二聚体结合两个AOS分子时（DP2-DP5模型），所有AOS模型都会使FGFR1二聚体发生变形。这些结果表明，AOS混合物对细胞增殖的双相效应可能归因于AOS五糖与FGFR1/FGF2蛋白的结合，但需要进一步实验来验证这一计算机预测结果。

引言

鼻咽癌（NPC）是一种与Epstein-Barr病毒（EBV）感染密切相关的上皮性头颈部癌症，在东南亚地区发病率很高，每年都有大量新病例和死亡病例报告[1]。尽管NPC在早期阶段通常可以治疗，但往往在晚期才被诊断出来，因此预后较差，尤其是男性和老年人的死亡率更高[2]。目前，同步化疗仍是治疗II期、III期、IVA期和IVB期NPC的主要方法，但化疗常伴随严重的不良反应。虽然正在开发针对EBV癌蛋白的新疗法，但目前仅有一种候选药物进入了临床试验阶段[3]。因此，迫切需要一种更安全、毒性更低的化疗替代品。其中，藻酸盐寡糖（AOS）特别具有吸引力，因为它们不仅具有抗肿瘤活性[4]，而且无毒、不引发免疫反应且可生物降解。 藻酸盐寡糖（AOS）是由2-10个β-D-甘露糖醛酸（M）和/或α-L-古洛糖醛酸（G）单元通过α/β-(1,4)-糖苷键连接而成的线性低分子量碳水化合物。AOS可通过多种方法从不同来源的藻酸盐中提取，包括生物、化学和物理方法[5][6][7][8]。这些方法得到的寡糖混合物在多聚M/多聚G的比例、聚合度和序列上各不相同。根据其组成，藻酸盐寡糖可分为三类：古洛糖醛酸寡糖、甘露糖醛酸寡糖和杂合寡糖。 此前已有研究表明AOS具有抗肿瘤作用。例如，Pan等人发现，通过藻酸盐裂解酶AlyB酶解藻酸盐制备的聚合度为2-5的AOS和AOS硫酸盐能够在三种不同的骨肉瘤细胞（MNNG、MG63和U2OS）中发挥抗肿瘤作用，IC50值分别为21.38-34.44 mg/mL和7.05-20.42 mg/mL[9]。Chen等人的早期研究使用来自Agarivorans sp. L11的藻酸盐裂解酶制备AOS，在细胞密度较高（4倍）条件下对MG63细胞的抑制作用更强，100 μg/mL的AOS处理48小时后仅剩三分之一的细胞存活[10]。Qiu等人的研究使用来自Cobetia marina的藻酸盐裂解酶制备的AOS（DP 2-4），在1 mg/mL浓度下对HepG2人肝癌细胞的抑制率分别为20-28%和42-50%，作用时间分别为48小时和72小时[11]。由于不同来源的藻酸盐裂解酶制备的AOS对不同类型癌细胞的抗肿瘤活性可能存在差异，本研究旨在探讨使用来自Persicobacter sp. CCB-QB4的藻酸盐裂解酶（仅包含催化结构域AlyQC）制备的AOS是否对鼻咽癌有效。 尽管AOS的抗肿瘤作用已被证实，但其分子机制仍不明确。例如，Pan等人提出AOS对骨肉瘤细胞的抗肿瘤作用可能与其抑制MEK1/ERK/mTOR信号通路有关[9]。另一项关于杂合藻酸盐硫酸盐（DP 8）的研究表明，高浓度下AOS能够将FGF2生长因子从细胞表面置换下来[13]。由于MEK1/ERK/mTOR信号通路与FGFR1激活密切相关（FGF2的靶蛋白），我们推测AOS可能通过抑制FGF2-FGFR1相互作用来发挥抗肿瘤作用。为了验证这一假设，本研究还检测了AOS对内源性表达FGFR蛋白的NIH-3T3成纤维细胞的影响，并进行了计算机模拟分子对接和分子动力学分析，以阐明AOS与FGF2、FGFR1及FGF2-FGFR1复合物的结合机制，因为这些因素对FGFR1的激活至关重要[14][15]。

不饱和藻酸盐寡糖的制备与表征

不饱和藻酸盐寡糖的制备与表征

根据Sim等人的方法[12]，表达了仅包含催化结构域AlyQC的Persicobacter sp. CCB-QB4来源的藻酸盐裂解酶并进行了纯化。为了制备不饱和藻酸盐寡糖（AOS），将2 mL纯化的AlyQc（浓度0.65 mg/mL）置于pH 7.0的磷酸盐缓冲液（PBS）中，与8 mL预先溶解在pH 7.0 PBS缓冲液中的20 mg/mL海藻酸钠（Sigma-Aldrich）在29°C下孵育16小时。之后去除酶和未反应的海藻酸钠。

AlyQC降解后的AOS产物包含二糖、三糖、四糖和五糖混合物

对海藻酸钠和AlyQC孵育16小时后的产物进行TLC分析（图1a）显示，不同聚合度的寡糖混合物呈现出明显的条带图案。具体来说，在乙醇沉淀后，TLC板上出现了四个不同的斑点，表明最终产物中含有四种低分子量寡糖。

结论

本研究通过体外细胞增殖实验表明，藻酸盐裂解酶降解后的藻酸盐寡糖能够在高于10 mg/mL的浓度下抑制C666-1 NPC细胞的生长。我们首次发现AOS具有类似肝素硫酸盐的双相效应。根据文献证据，我们推测这种效应的部分原因可能是AOS对细胞增殖的双相调节作用。

作者贡献声明

Darshini Mohan：撰写初稿、方法设计、实验实施、数据分析。 Beow Keat Yap：审稿与编辑、项目管理、资金争取、数据管理、概念构思。 Jian Cheng Henry Choong：实验设计。 Vikneswaran Murugaiyah：实验指导、资源提供。 Aik-Hong Teh：实验指导、资源提供、概念构思。 Boon-Keat Khor：方法设计。

利益冲突声明

作者声明不存在可能影响本文研究的已知财务利益或个人关系。

数据获取

数据可应要求提供。

利益冲突声明

作者声明不存在可能影响本文研究的已知财务利益或个人关系。

致谢

作者感谢马来亚大学的Yap Lee Fah教授和敦库阿卜杜勒拉赫曼大学的Leong Pooi Pooi副教授慷慨提供C666-1细胞系，以及马来西亚科学大学的Ana Masara Ahmad Mokhtar博士提供NIH-3T3细胞系。本研究得到了马来西亚科学大学研究团队（RUTeam）的资助（项目编号：1001/PFARMASI/8580033）。