影响胞质受体构象和区域相互作用的分子机制，以及这些机制如何受到磷酸基团多样性的影响

《International Journal of Biological Macromolecules》：Molecular mechanism underlying conformations and region communications of periplasmic receptor affected by diversity of phosphate groups

XAC2383磷酸受体结合不同磷酸配体引发构象变化及信号传导机制研究，通过GaMD分子动力学模拟结合MSMs和通信路径分析，发现PO4、POP和ATP显著改变L1-L5环和β2-L-α2区域的构象，影响配体与K193残基的相互作用网络，调控XAC2382的鸟苷酸环化酶活性。

　　

Jianzhong Chen|Jian Wang|Wei Wang|Lu Zhao|Handong Jin|Guodong Hu

山东交通大学理学院，济南，250357，中国

摘要

周质受体（XAC2383）对磷酸盐配体表现出显著的亲和力，在配体结合时会发生构象变化。理解这种偏好背后的分子机制对于全面掌握XAC2383的功能至关重要。在本研究中，我们应用高斯加速分子动力学（GaMD）模拟结合马尔可夫状态模型（MSMs）和信号通路分析来研究配体对XAC2383构象动态的影响。通过对MSMs的分析，我们发现三种磷酸盐配体（PO?、POP和ATP）诱导的构象状态较少，并且与无配体的APO形式的XAC2383相比，显著改变了L1-L5环和β2-L-α2区域的构象。这一发现得到了主成分分析（PCA）的支持。信号通路分析进一步表明，这些配体的结合改变了APO XAC2383中的信号通路，通过L1、α6、α7和α9建立了两个叶之间的直接通信。相互作用指纹分析显示，残基K193在所有三种配体的相互作用指纹中都起着关键作用，对于调节信号网络至关重要。总体而言，我们的发现为XAC2383的功能机制提供了宝贵的见解。

引言

XAC2383是一种由植物病原菌Xanthomonas citri subsp. citri（柑橘溃疡病的致病菌）编码的周质结合蛋白（PBP）。它属于一个双组分信号转导系统，该系统还包括与焦磷酸结合的Xanthomonas citri来源的膜相关二鸟苷酸环化酶XAC2382[1]、[2]、[3]。这两种蛋白质共同转录并在功能上相互关联，形成一个响应细胞外含磷酸化合物的调控模块[1]。从结构上看，XAC2383采用了典型的周质结合蛋白折叠方式，由一个铰链区域连接的两个叶组成，形成了类似捕蝇草的架构。XAC2383的高分辨率晶体结构显示，在两个叶之间有一个带正电荷的配体结合槽（图1B），可以容纳磷酸盐、焦磷酸和ATP等含磷酸的阴离子配体[1]。该槽中的一个保守的Ser-Thr-Ser（STS）基序在协调结合配体的磷酸部分中起关键作用，显示出对磷酸化化合物的选择性偏好[4]、[5]、[6]、[7]。因此，了解不同磷酸基团对XAC2383构象变化的影响对于深入理解其功能具有重要意义。

功能上，XAC2383作为周质传感器，调节其相应的膜结合伙伴XAC2382的活性。XAC2382包含二鸟苷酸环化酶（GGDEF基序）和磷酸二酯酶（EAL）结构域[1]、[7]、[8]、[9]，并参与调节细胞内第二信使环二鸟苷酸（c-di-GMP）的水平[2]、[10]、[11]、[12]、[13]。由于配体结合，XAC2383与XAC2382的周质Cache结构域相互作用，导致其构象变化，从而抑制了二鸟苷酸环化酶的活性，并阻碍了与二鸟苷酸环化酶的相互作用[14]、[15]、[16]、[17]、[18]、[19]。这种相互作用降低了c-di-GMP的水平，影响了细菌的运动性和生物膜的形成，这是X. citri致病性和环境适应的关键过程。因此，探究XAC2383的构象变化对于进一步理解XAC2383及其与XAC2382的相互作用非常重要。

事实上，XAC2383–XAC2382系统在包括革兰氏阴性和革兰氏阳性菌在内的多种细菌门中都得到了保守[7]，表明其在细菌信号传导中的进化重要性。该系统的模块化特性，具有保守的周质输入结构域（XAC2383–Cache）和可变的细胞质输出结构域（例如GGDEF–EAL、组氨酸激酶），突显了其适应性和在多种调控网络中的潜在作用[1]。总之，XAC2383被认为是一种对磷酸敏感的周质受体，通过与XAC2382的直接相互作用来调节c-di-GMP信号。其结构提供了关于配体特异性和信号转导机制的见解，而其生物学作用强调了磷酸感知在细菌致病性和适应中的重要性。然而，由于缺乏不同磷酸配体介导的构象变化数据，限制了对XAC2383功能的理解。因此，探究磷酸基团多样性对XAC2383构象动态影响的分子机制对于阐明其在抑制XAC2382二鸟苷酸环化酶活性中的作用至关重要。

在研究蛋白质构象动态的计算方法领域，分子动力学（MD）模拟[20]、[21]、[22]、[23]和自由能分析[21]、[24]、[25]、[26]被广泛使用。传统的MD（TMD）模拟经常面临构象采样不足和容易陷入局部最小值的挑战。然而，Miao等人最近引入的高斯加速分子动力学（GaMD）方法[27]、[28]、[29]、[30]克服了这些限制，实现了更全面的构象采样并避免了局部最小值。将TMD和GaMD模拟与马尔可夫状态模型（MSMs）结合使用，在识别不同状态之间的构象转变方面被证明是有效的[31]、[32]、[33]、[34]、[35]。将多个副本MD模拟与MSMs的构建相结合，在识别目标蛋白的别构调节机制和别构药物设计中也发挥了关键作用[36]、[37]、[38]、[39]、[40]、[41]。例如，将MSMs的构建与随机加速分子动力学（RAMD）模拟相结合，揭示了多肽N-乙酰半乳糖胺转移酶2中肽底物识别的构象动态[42]。此外，通过微秒级MD模拟和MSMs阐明了G蛋白和L蛋白及其突变体的折叠机制[43]。我们之前的研究将TMD和GaMD模拟与MSMs结合，探讨了多位点磷酸化对配体结合的Janus激酶3构象动态的影响[44]，以及真核核糖开关中的配体诱导的构象重排[20]。同样，微秒级TMD/GaMD模拟与MSMs的结合也被用于研究丙氨酸-丝氨酸-半胱氨酸转运蛋白2介导的谷氨酰胺转运的动态机制[34]。这些可靠的计算工具为研究不同磷酸基团对XAC2383构象变化的影响提供了有效的方法。

为了实现我们的目标，选择了三种含有PO?、POP和ATP的磷酸基团分子[1]，以研究不同磷酸基团存在时XAC2383的构象变化。这三种分子带有不同的净负电荷：PO?带有三个负电荷，POP带有两个负电荷，ATP带有四个负电荷，导致它们的静电性质不同。它们的结构分别显示在图1D-1F中。此外，PO?、POP和ATP的分子大小也存在显著差异，尤其是ATP的腺嘌呤基团。了解这些静电性质和分子大小的差异如何影响XAC2383的构象变化对于更深入地理解其功能至关重要。在当前研究中，我们将GaMD模拟、MSMs构建、信号通路分析、主成分分析（PCA）[45]、[46]、[47]、[48]、[49]和相互作用指纹分析结合起来进行研究。同时，这项工作有望为阐明XAC2383功能的分子机制和构象动态提供有价值的理论支持。

模拟系统设置

未结合的XAC2383（APO-5UB3）的初始坐标来自蛋白质数据库（PDB）中的条目5UB3[1]。与PO?、POP和ATP结合的XAC2383的起始坐标分别来自它们的晶体结构，PDB条目分别为5UB4、5UB6和5UB7[1]。在这些初始模型中，保留了水分子、PO?、POP和ATP，而其他配体则从起始模型中移除。XAC2383的质子化状态是在生理pH值下确定的

后处理分析揭示的XAC2383的结构特征

为了研究配体结合对XAC2383结构稳定性的影响，我们计算了重原子均方根偏差（RMSDs）。XAC2383的RMSDs范围在1.4到5.5 ?之间（图S1A）。具体来说，APO、POP结合和ATP结合的XAC2383的RMSDs分别为2.12、2.25和2.06 ?。相比之下，PO4结合的XAC2383的RMSD在2.26和3.08 ?处有两个峰值（图2A），表明ATP结合导致的结构波动较小

讨论

基于动态特征的分析，三种磷酸盐配体的不同大小和静电性质对XAC2383的结构变化产生了显著影响。与PO4和POP相比，ATP结合更有效地稳定了XAC2383的结构，使其构象更加紧凑。ATP还降低了XAC2383的溶剂可及性，并诱导更多的水分子释放到溶剂中，从而对XAC2383的亲水性产生了更大的影响。

结论

XAC2383是一个响应细胞外含磷酸化合物的调控模块，优先结合磷酸盐配体。进行了三次独立的2-μs高斯加速分子动力学（GaMD）模拟（总计6 μs），以增强XAC2383相关系统的构象采样，并揭示了这种偏好的分子机制。构建了MSMs来检查配体介导的构象转变。结果表明，PO4、POP和ATP

CRediT作者贡献声明

Jianzhong Chen：撰写 – 审稿与编辑，撰写 – 原始草稿，可视化，验证，方法学，资金获取，正式分析，概念化。Jian Wang：可视化，验证，软件，正式分析。Wei Wang：可视化，验证，软件，正式分析。Lu Zhao：可视化，验证，软件，正式分析。Handong Jin：可视化，验证，软件，正式分析。Guodong Hu：监督，方法学，概念化。

资助

本工作得到了山东交通大学的Tuojiang学者（编号：TJXZ202204）的高素质人才支持，以及山东省自然科学基金（编号：ZR2021MA069）的资助。

利益冲突声明

作者声明没有竞争性财务利益。