双重敏化剂（KA与DPA）共修饰氧化铕纳米颗粒：长寿命、高信噪比的时间门控生物成像新策略

《ACS Applied Optical Materials》：Increased Time-Gated Eu-Centered Emission Intensity from Europium Oxide Nanoparticles Sensitized with Kynurenic Acid and Dipicolinic Acid in Tissue Samples

本研究针对传统荧光探针在生物成像中易受组织自发荧光干扰、光稳定性差、斯托克斯位移小等问题，开发了一种新型氧化铕纳米颗粒成像剂。研究人员通过在Eu2O3纳米颗粒表面共价修饰大尿酸（KA）和二吡啶甲酸（DPA）两种敏化剂，成功合成了EuPEGKADPA复合物。该体系在Tris缓冲液中展现出长达1.244 ms的发射寿命和1.7%的量子产率，并在组织裂解液环境中实现了比组织自发荧光高约60%的发射强度。尤为重要的是，借助时间门控技术，其信噪比提升了近800倍。在DPX封片剂固定的组织样本中，与罗丹明B相比，该纳米颗粒在浓度检测限上实现了15倍的提升，验证了其在生物成像，尤其是离体成像应用中的巨大潜力。

　　

在生物医学研究和临床诊断领域，光学成像技术如同一盏照亮生命微观世界的明灯。然而，这盏“灯”的亮度常常被一层名为“组织自发荧光”的厚厚迷雾所干扰。传统的有机染料和荧光蛋白等探针，虽然色彩鲜明、定位精准，但它们自身的“闪烁”时间太短，且容易被“漂白”（光漂白），发出的光波长也容易与生物组织自身发出的微弱荧光“撞色”，导致目标信号被背景噪音无情淹没。为了穿透这层迷雾，科学家们将目光投向了镧系元素。这类元素离子，如铕（Eu(III)），拥有独特的光学特性：它们能发出尖锐的、像激光一样纯净的特征谱线，而且几乎不会被“漂白”。最吸引人的是，它们的发光寿命极长，能达到微秒甚至毫秒级别，这远比生物组织自身纳秒级的自发荧光要长得多。这就好比在一个嘈杂的派对上，普通探针的声音瞬间就被淹没，而镧系探针的声音则能持续数秒，我们可以通过“延迟聆听”（即时间门控检测）的方式，轻松地将它的声音从背景噪音中分离出来。然而，直接激发镧系离子本身效率很低，通常需要通过“天线”（即敏化配体）来捕获光能并传递给它们。先前的研究已经证明，大尿酸（KA）和二吡啶甲酸（DPA）都是有效的铕离子敏化剂，但各有优劣：DPA敏化效率高，但其最佳激发波长在紫外区（~285 nm），对生物组织有潜在光损伤；KA能在更温和的波长（~340 nm）激发，但单独使用时对纳米颗粒表面的保护不足，导致发光寿命较短。那么，能否“强强联合”，创造一种兼具二者优点的“超级”成像探针呢？

为了回答这个问题，发表在《ACS Applied Optical Materials》上的一项研究，巧妙地将KA和DPA两种敏化剂同时修饰到聚乙二醇（PEG）包被的超小氧化铕（Eu₂O₃）纳米颗粒表面，构建了名为EuPEGKADPA的新型纳米探针。研究表明，这种复合系统成功结合了KA的低能量激发优势和DPA优异的表面钝化能力，在生物组织环境中实现了前所未有的长发光寿命、高信噪比和更低的检测限，为高对比度、低背景干扰的生物成像，特别是离体组织成像，开辟了一条新的道路。

为开展此项研究，作者运用了几个关键技术方法：首先是改进的多元醇法合成超小Eu₂O₃纳米颗粒核心。其次，通过配体交换反应，将PEG、KA和DPA依次或共同修饰到纳米颗粒表面，并进行纯化。研究中对纳米颗粒进行了包括透射电子显微镜（TEM）、衰减全反射红外光谱（ATR-IR）和紫外-可见吸收光谱在内的系统表征，以确认其形貌、尺寸、晶体结构及配体成功修饰。光物理性质研究则通过稳态/时间分辨荧光光谱测量了纳米颗粒的激发/发射光谱、发光寿命和量子产率。关键的生物应用验证实验包括：在组织裂解液中评估纳米颗粒与自发荧光的对比度（通过激发-发射矩阵分析），以及在不同封片剂（DPX, ProLong Diamond, Permount）中测试其发光性能，并与传统染料罗丹明B进行检测限的直接比较。用于测试的组织样本为脑组织裂解液。

研究结果

纳米颗粒核心合成与表征

通过透射电子显微镜验证，所合成的EuPEGKA和EuPEGKADPA纳米颗粒平均核心尺寸分别为5.6 nm和3.8 nm，显示出超小的特性。高分辨率TEM图像显示了清晰的晶格条纹，表明其结晶性良好，晶面间距与体心立方结构的Eu₂O₃相符。

配体交换

通过ATR-IR光谱确认了KA和DPA成功修饰在纳米颗粒表面。与纯配体相比，EuPEGKA在~1500 cm^-1处出现KA环中C=C键的特征峰，而EuPEGKADPA则在~1700 cm^-1处出现了羧基C=O的特征峰，在~1428和1568 cm^-1处出现了COO^-的对称和不对称伸缩振动峰。紫外-可见吸收光谱进一步证实，EuPEGKADPA同时具有KA（243 nm和332 nm）和DPA（270 nm）的特征吸收带。

铕(III)敏化

光致发光研究表明，PEG本身不能敏化Eu(III)发光。EuPEGDPA在282 nm处有最大激发，EuPEGKA在354 nm处有配体激发带，而EuPEGKADPA则同时具有350 nm和377 nm的配体激发带以及395 nm的Eu(III)直接激发峰。exc = 395 nm, purple), and emission (λ_exc= 340 nm, green) of PEG- (A), DPA- (B), KA- (C), and KADPA- (D) capped NPs. λ_em= 616 nm in Milli-Q (18.2 MΩ) water. [NP] = 1 × 10^–5M. Excitation and emission slit widths were 3 nm. DPA was excited at 282 nm.">发射光谱均显示出来自⁵D₀→ ⁷F_J(J=0-4)的特征Eu(III)发射峰。寿命测量显示，EuPEGKADPA具有最长的发射寿命，达到1.244 ms，远长于单独使用KA（0.160 ms）或DPA（0.296 ms）的体系，这表明DPA和KA的协同作用有效保护了Eu(III)离子，减少了溶剂振动引起的非辐射淬灭。5D₀→ ⁷F₂transition at 616 nm for EuPEG (green squares), EuPEGDPA (yellow stars), EuPEGKA (blue triangles), and EuPEGKADPA (purple circles) with respective fits (black lines).">量子产率测量结果为：EuPEGKA 5.1%，EuPEGDPA 13.2%，EuPEGKADPA 1.7%。尽管EuPEGKADPA的敏化效率（η_sens）最低（0.1%），但其内在量子产率（φ_Eu^Eu）最高（18.7%），再次证实了其卓越的表面钝化效果抑制了非辐射衰减。

有/无时间门控时的自发荧光干扰

在组织裂解液环境中，通过激发-发射矩阵评估了纳米颗粒与自发荧光的对比。在正常（同时）信号采集模式下，EuPEGKADPA的信号与组织噪音之比仅为1.63，而罗丹明B高达620。然而，当应用200 μs延迟的时间门控技术后，情况发生逆转：EuPEGKADPA的信噪比激增至797，实现了近800倍的提升，而罗丹明B的信噪比则降至40。这凸显了长寿命镧系探针结合时间门控技术在抑制短寿命组织自发荧光方面的巨大优势。

封片剂对发光的影响

测试了不同封片剂对纳米颗粒发光的影响。在正常采集模式下，只有使用DPX（一种二甲苯基封片剂）时能观察到明显的Eu(III)发射。exc = 340 nm) of EuPEGKA in different mounting media: normal signal collection (A) and time-resolved detection (B).">在时间门控模式下，三种封片剂中均能检测到Eu(III)发射，但DPX效果最佳。基于此，进一步在干燥的脑组织裂解液样本（模拟固定组织切片）中比较了EuPEGKADPA与罗丹明B在DPX中的性能。EuPEGKADPA在干燥状态下的发光寿命进一步延长，衰减至初始强度50%所需时间从溶液中的0.2 μs延长至1.9 ms。在浓度检测限的比较中，EuPEGKADPA在20 nM浓度下能达到与罗丹明B在300 nM时相当的信噪比，意味着在纳米颗粒数量浓度基础上，其检测限比罗丹明B改善了15倍。

研究结论与讨论

本研究的核心结论是，通过将大尿酸（KA）和二吡啶甲酸（DPA）共修饰到PEG化的Eu₂O₃纳米颗粒表面，成功构建了新型成像探针EuPEGKADPA。该系统综合了两种敏化剂的优势：KA提供了在生物相容性更好的紫外A区（~340 nm）的激发窗口，而DPA则作为高效的表面钝化配体，显著减少了溶剂分子对Eu(III)激发态的振动淬灭。这种协同作用使得EuPEGKADPA在Tris缓冲液中获得了长达1.244 ms的发射寿命，这是在所有测试体系中观察到的最大值。

这项工作的重大意义体现在三个方面：首先，在机理层面，它证实了使用组合配体策略（Cosensitization）可以同时优化纳米探针的激发波长和表面钝化效果，从而协同提升其发光性能，这为设计下一代高性能镧系纳米探针提供了新的思路。其次，在技术性能层面，研究通过系统的体外和模拟组织环境测试，量化证明了EuPEGKADPA在时间门控模式下能将信噪比提升近800倍，并能在DPX封片的干燥组织中实现比经典有机染料罗丹明B高15倍的浓度检测灵敏度，充分展示了其在抑制背景荧光、实现高对比度成像方面的卓越潜力。最后，在应用层面，这项工作不仅验证了配体敏化Eu(III)纳米颗粒用于生物成像的可行性，还特别评估了不同商业封片剂对其发光性能的影响，发现了DPX的优越兼容性，这为将其实际应用于离体组织切片成像（例如免疫荧光、病理检测等）提供了至关重要的实践指导。尽管其量子产率（1.7%）并非最高，但其超长的发光寿命、高信噪比和更优的检测限共同确立了EuPEGKADPA作为一种有前景的生物成像对比剂的地位，推动了镧系纳米材料在生物医学光学成像领域的应用边界。