《ACS Nano》：Comment on “Polylactic Acid Micro/Nanoplastic Exposure Induces Male Reproductive Toxicity by Disrupting Spermatogenesis and Mitochondrial Dysfunction in Mice”
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PLA微纳米塑料通过血睾屏障引发精子质量下降和激素失衡，其机制涉及线粒体功能障碍及氧化应激，且降解产物乳酸可能影响生殖系统。
在他们的最新研究中，赵等人报告了聚乳酸（PLA）微塑料/纳米塑料（PLA-MPs）对雄性哺乳动物的生殖毒性及其潜在机制。
(1) 作者证明，口服摄入的PLA-MPs可以在消化系统中降解为纳米塑料，穿过血-睾丸屏障（BTB），并在生精细胞和精子中积累。这些颗粒会干扰精子生成过程，降低精子质量，并影响激素水平。值得注意的是，该研究将PLA-MPs的暴露与线粒体功能障碍、氧化应激以及睾丸和精子线粒体的结构损伤联系起来。转录组分析进一步揭示了参与精子生成的关键基因的表达下调。
作者主要关注PLA-MPs对生殖系统的毒性作用，而对摄入的PLA的降解过程讨论较少。PLA是一种环保且易于生物降解的材料，会降解为乳酸。在评估PLA的体内毒性时，必须考虑其降解产物代谢可能引入的混杂因素。
PLA是一种脂肪族聚酯，主要通过酯键的水解作用进行降解，无需酶的参与（非酶促水解）。虽然是非酶促水解，但在生理条件下，某些蛋白酶和脂肪酶的酶活性可以显著加速PLA的降解。降解速率受多种因素影响，包括化学结构、分子量、结晶度、环境条件（温度、pH值、微生物等）以及是否与其他聚合物混合。
(2) 在水环境中（例如37°C和pH 7.4的磷酸盐缓冲盐水），PLA的降解速率较慢。
(3) 在体内，PLA的降解还受到酶活性、细胞反应和局部生理条件的影响。
(4) 研究表明，PLA植入物会在1到5年内逐渐降解，质量减轻且分子量减少，具体取决于植入部位和材料特性。此外，酸性降解产物可能引发轻微的炎症反应。
(5?7)
乳酸是男性生殖细胞的重要能量来源，主要由塞尔托利细胞产生，通过单羧酸转运蛋白（MCTs）运输，并被生殖细胞用于ATP的生成。
(8) 乳酸在塞尔托利细胞中也是一种重要的信号分子，可调节MAPK和PI3K-AKT等增殖和存活通路。在男性生殖系统中，适度的乳酸浓度增加对精子生成和成熟至关重要。在病理条件下，乳酸代谢紊乱常常导致细胞功能障碍，并与男性不育密切相关。
(8?10) 除了作为代谢物外，乳酸还可以作为蛋白质乳酸化的底物。
(11) 鉴于上述情况，在实验设计中评估PLA-MPs的体内和体外降解过程是必要的，无论降解是否可能引入混杂因素。在赵等人的研究中，作者使用了市售的PLA-MPs在小鼠和细胞模型中进行实验。小鼠的给药剂量为每天10、100和1000毫克/千克，细胞系的剂量为0、20、100和500微克/毫升。PLA-MPs具有较大的表面积，理论上更容易发生降解。因此，我们提出几个问题：(1)当PLA-MPs穿过血-睾丸屏障并被细胞吞噬时，它们是否会在细胞内发生局部降解？(2)如果发生降解，是否会导致局部乳酸水平升高？(3)如果局部乳酸水平升高，是否会影响细胞功能？
为此，我们设计了一个简单的实验来评估PLA在细胞培养条件下的降解情况。在细胞实验中，通常使用胰蛋白酶作为细胞传代的试剂。为了评估PLA在细胞培养基中的降解情况，我们使用3D打印技术制备了PLA片材。在与胰蛋白酶（含有酚红）共同孵育的过程中，10分钟内观察到了颜色变化，2小时后颜色稳定为黄色且不再变化（
图1 A）。如图所示，在DMEM + 10% FBS培养基中，24小时内乳酸水平没有显著升高（
图1 B）。当PLA片材与胰蛋白酶共同孵育时，培养基中的乳酸水平略有升高。
图1 图1. (A) 3D打印的PLA片材在培养基或胰蛋白酶中孵育24后的降解分析。当PLA片材与DMEM + 10% FBS共同孵育时，培养基中的乳酸水平保持不变，而在胰蛋白酶组中乳酸水平显著升高（****p < 0.001）。(B) PLA片材在不同培养基中孵育2小时后的形态。
需要明确的是，这个简单的体外模型使用无细胞培养基中的PLA片材，并不是为了模拟微粒的细胞内降解、局部乳酸积累或直接的细胞效应。其主要目的是提供一个受控的概念验证，证明PLA材料本身并非惰性物质，在温和的常规细胞培养条件下可以发生水解并释放乳酸。
需要注意的是，PLA衍生的乳酸对睾丸毒性的全身影响取决于其代谢命运。口服后，PLA-MPs预计会在小鼠体内发生酶促降解。然而，肠道中产生的乳酸可能被微生物群利用或全身代谢，
(12,13) 这可能限制其到达睾丸的生物利用度。直接效应可能需要PLA-MPs在睾丸细胞内的局部降解。此外，除了乳酸之外，降解产物的物理和化学性质也需要单独考虑。PLA-MPs的潜在降解及其产生的代谢物（如乳酸）的局部释放是解释机制途径时需要考虑的混杂因素。
尽管我们的有限数据表明，在这些简化条件下PLA的降解是可测量的，但这些发现仍属于探索性质，不能直接推广到复杂的体内或细胞内环境。我们的目的不是提供确凿证据，而是强调一个在可降解微塑料的机制毒理学研究中尚未充分探讨的变量（如PLA的生物降解性和其生化产物）。我们希望强调，这篇评论是对方法论改进的建议。原始研究的发现本身具有价值，我们的目的是促使未来的研究将PLA降解视为一个潜在的混杂因素，从而加强证据链。
从科学方法论的角度来看，任何可能影响结果的变量都应被控制，无论其影响程度如何。设立对照组的目的正是为了隔离和考虑潜在的混杂因素，即使它们的贡献预计很小。没有控制PLA降解并不使原始研究无效，但包含对照组可以通过排除额外变量来加强证据链。
因此，我们建议作者和其他研究人员在实验设计中考虑PLA降解的可能性，因为即使是微小的局部效应也可能影响机制的解释。区分PLA-MPs及其降解产物效应的对照实验对于加强证据至关重要。未来的工作应采用先进的分析技术和生理模型来验证降解过程，量化局部乳酸释放，并明确降解产物在毒性中的作用。这篇评论对作者的全面工作表示赞赏，并就实验设计提出了一些建议。未来的研究设计可以从这些建议中受益，以避免潜在的混杂因素。
3D模型是在Autodesk Fusion 360（Autodesk，美国加利福尼亚州圣拉斐尔）中设计的，并导出为STL文件。模型导入到适用于FDM打印机的Orca Slicer切片软件中。使用商业PLA 3D打印丝材（eSUN，中国）制作了尺寸为1.0厘米×1.0厘米×0.1毫米的片材。根据制造商的产品数据表，这种PLA的密度为1.24克/立方厘米。然后，这些片材在标准条件（37°C，5% CO2 ）下分别在含有10% FBS的1.0毫升DMEM或1.0毫升胰蛋白酶中孵育24小时。随后使用乳酸测定试剂盒（beyotime，中国）对培养基中的乳酸水平进行定量。
